血小板裂解液对组织工程心脏瓣膜体外构建作用的实验研究

发布时间：2017-10-27 01:28

  本文关键词：血小板裂解液对组织工程心脏瓣膜体外构建作用的实验研究

  更多相关文章： 骨髓间充质干细胞 组织工程 心脏瓣膜 血小板裂解液 黏附

【摘要】：背景：组织工程心脏瓣膜(the tissue engineered heart valves,TEHV)的构建是将种子细胞成功地种植到瓣膜支架上,从而进一步构建成具有细胞生长的组织工程心脏瓣膜。细胞和支架之间的相互作用,如细胞在支架上的迁移、分化、增殖等,都是以细胞和支架的黏附为基础。研究发现,体外种植、培养所形成的组织工程心脏瓣膜的种子细胞黏附力较低,而且生理功能与正常细胞相比明显不足。因此,如何促进种子细胞与瓣膜支架粘附,进而分化、增殖仍是THEV体外构建的关键所在。 血小板裂解上清液(platelet lysates,PL)富含许多生长因子如：血小板衍生生长因子、转化生长因子p1、胰岛素样生长因子和血管内皮细胞因子等。生长因子能够发挥最大生物效应,依靠多种生长因子之间的相互调节,很多研究表明单因子对组织修复作用有限。 目的：将大鼠骨髓干细胞种植于去细胞猪主动脉瓣膜支架上,体外构建组织工程心脏瓣膜。通过改变静态培养的环境条件,观察大鼠BMSCs在支架上的黏附、生长情况及体外构建的TEHV进行冲刷实验,从而评价PL促进并增强种子细胞黏附力的效果。 方法： (一)大鼠BMSCs的分离,培养及鉴定：使用全骨髓分离培养法,DMEM-F12培养液体外培养扩增。采用相应的流式抗体CD34-FITC、HLA-DR-PE、 CD45-PERCT、CD90-FITC进行细胞表型鉴定。 (二)PL的制备：参照宋会平等方法以3次离心结合反复冻融法制备血小板裂解液。10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g),自大鼠心内采血6mL,肝素抗凝,室温下150g离心10min。取上清和血小板层细胞室温下1500g再次离心10min获取沉淀的血小板,用2mLPBS液(PH7.2)重悬。连续反复冻融(-80℃/37℃)5次,4℃下8000g离心30min去除血小板膜和其他细胞残片,-80℃冻存备用。 (三)PL促进大鼠BMSCs在瓣膜支架上的分裂及黏附力的研究 1、组织工程心脏瓣叶的制备：采用0.25%Trition、025%的脱氧胆酸钠、0.02%的EDTA、RNA酶和DNA酶溶液,37摄氏度震荡48小时进行去细胞处理,通过组织学切片、电镜检查观察去细胞效果。采用去细胞猪主动脉瓣叶作支架,分A(10%FBS-DMEMF-12)、B (10%FBS-DMEMF-12-25%PL)、C(10%FBS-DMEMF-12-5%PL)和D (10%FBS-DMEMF-12-75%PL)4组,每组16个瓣叶,BMSCs作为种子细胞,体外构建TEHV,于构建后第7天通过瓣叶上BMSCs的光镜计数、MTT法、组织切片、电镜检查等进行瓣叶上BMSCs的黏附、生长状态的变化。 2、TEHV的体外冲刷实验：实验分2大组,为静态组和实验组,每组再分4组,分别为A、B、C、D,每组16个瓣叶。构建后进行MTT检测及瓣叶细胞计数。实验组第7天进行冲刷实验,持续24小时。通过瓣叶上BMSCs光镜计数、MTT法、组织切片等检查观察BMSCs的存留情况。 结果： 1、用全骨髓培养法获得的大鼠骨髓间充质干细胞经原代培养和连续传代后,呈梭形、指数增殖,细胞形态有多形性逐渐趋向一致。流式细胞仪分析CD45、 HLA-DR阴性率达,CD34、CD90阳性率达,符合骨髓间充质干细胞的表型特征。 2、HE染色：HE染色显示采用曲拉通法能够完全去除猪主动脉瓣叶上的细胞成分,脱细胞处理的猪主动脉瓣叶为白色半透明,质地柔软,未见细胞及细胞碎片成分,纤维网结构基本完整。新鲜猪主动脉瓣叶中可见许多蓝色深染的细胞核及正常瓣叶结构,未见明显空白区域。 3、用大鼠BMSCs构建的TEHV瓣叶HE染色显示B组、C组和D组的BMSCS在去细胞瓣叶表面呈复层生长,形成连续细胞层。而A组,虽然在瓣膜表面形成了细胞层,但细胞与基质黏附不紧,有的部位没有细胞覆盖。透射电镜显示,去细胞瓣叶的纤维结构保存完整。MTT法和细胞计数显示D三组瓣叶上黏附的细胞数明显多于C、B、A组,而C、D两组又明显多于B组。 4、TEHV的体外冲刷实验后,细胞计数和MTT示A组、B组在遭遇高速流体冲刷后的细胞计数[分别为(2.25±0.28)×104、(2.93±0.28)×104]少于C、D2组[(3.56±0.31)×104、(4.68±0.46)×104](p0.05),D组细胞数明显多于A、B、C3组(p0.05),提示该实验有检验细胞黏附力的价值。同时HE染色显示冲刷试验后细胞存留的较少,C、D组瓣膜表面存留细胞密度多于A、B2组。 结论： 1、采用曲拉通法能够较好去除猪主动脉瓣膜上的细胞 2、PL能够促进BMSCs在瓣叶支架上的增殖及黏附能力,并随着其浓度的增加而增强,7.5%PL浓度较为理想。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 组织工程 心脏瓣膜 血小板裂解液 黏附
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 1. 材料与方法14-23
• 1.1 研究对象14
• 1.1.1 动物选择14
• 1.1.2 分组14
• 1.2 实验模型建立14-17
• 1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞获取14-15
• 1.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞培养15
• 1.2.3 大鼠骨髓间充质干细胞鉴定15-16
• 1.2.4 BMSCs的冻存及复苏实验16
• 1.2.5 血小板裂解液的制备16-17
• 1.2.6 去细胞猪主动脉瓣叶支架的制备17
• 1.2.7 骨髓间充质干细胞种植于去细胞主动脉瓣叶支架17
• 1.3 主要仪器及试剂17-19
• 1.3.1 主要仪器设备(本实验所用实验设备均由河南省神经病学研究所提供)17-18
• 1.3.2 主要试剂18-19
• 1.3.3 主要缓冲液与工作液19
• 1.4 研究方法19-22
• 1.4.1 石蜡切片制作20
• 1.4.2 观察病理学变化20
• 1.4.3 透射电镜(TEM)样品的制备20-21
• 1.4.4 构建好的TEHV细胞计数21
• 1.4.5 THEV的MTT检测21-22
• 1.4.6 THEV的体外冲刷实验22
• 1.5 统计学分析22-23
• 2. 结果23-27
• 2.1 大鼠BMSCs形态学观察及生长曲线的测定23
• 2.2 大鼠BMSCs的流式细胞仪鉴定结果23
• 2.3 HE染色镜下观察23-24
• 2.4 电镜观察24
• 2.5 种植后第7天瓣叶上细胞数和MTT检测结果24-25
• 2.6 体外冲刷实验后瓣叶上存留的细胞数和MTT检测结果25-27
• 3. 讨论27-34
• 3.1 组织工程心脏瓣膜种子细胞的来源27-28
• 3.2 组织工程心脏瓣膜支架材料的选择28-29
• 3.3 瓣膜支架的去细胞方法29
• 3.4 瓣膜种子细胞种植方法29-30
• 3.5 组织工程心脏瓣膜的构建30-31
• 3.6 组织工程心脏瓣膜与临床的研究31
• 3.7 血小板裂解液的研究31-32
• 3.8 血小板裂解液的制备过程32
• 3.9 体外冲刷实验检测细胞黏附力的研究32-33
• 3.10 本课题的创新之处33-34
• 4. 结论34-35
• 附图35-43
• 参考文献43-46
• 综述46-55
• 参考文献52-55
• 英文缩写词汇表55-56
• 攻读学位期间发表文章情况56-57
• 致谢57-58
• 个人简历58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 宋强;心脏组织工程研究新进展[J];临床心血管病杂志;2003年04期

2 赵强,孙晓宁,徐德民,陈安清;组织工程心脏瓣膜支架制备方法研究[J];中国临床医学;2004年01期

3 王鹏;李超;谈磊;张润起;张雷;;三种去细胞组织工程异种瓣膜支架制备方法比较[J];山东医药;2009年26期

4 张晓彤,刘迎龙;组织工程化心脏瓣膜[J];天津医科大学学报;2004年03期

5 宋会平;王志强;赵亚平;陈学英;张育敏;康悦;张康蓉;李宝兴;;血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年21期

6 马金本;单根法;韩绍先;钟z，

本文编号：1101364