基于特异性相互作用的基因活性组织修复材料的构建及性能研究

发布时间：2017-10-29 13:25

  本文关键词：基于特异性相互作用的基因活性组织修复材料的构建及性能研究

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【摘要】：组织修复再生材料中生物活性信号的仿生释放,是获得类天然组织的关键。随着基因技术的发展,在基因水平调控细胞行为成为可能。负载了治疗性基因的组织修复材料,即基因活性支架,可实现基因的高效负载、定域转染,因而逐渐成为研究的新方向。但较低的转染效率限制了基因活性支架材料的研究与应用。转染效率是基因从基质材料中解离到进入细胞核众多过程共同作用的结果。DNA从材料中的解离是转染的第一步,但是这一部分研究报道比较少。因此,本文的核心思想是：从仿生学角度出发,将特异性相互作用引入到基因活性材料体系,通过调节DNA与材料的结合方式,研究结合方式对DNA转染效率的影响。 首先将生物素-亲和素特异性相互作用引入材料体系。成功的将生物素接枝到了聚乙烯亚胺上(B-PEI),接枝率11.7%。B-PEI可通过静电相互作用与DNA络合为纳米粒子；当N/P=5时,B-PEI/DNA粒子的粒径为170nm,电位为16.1mV,透射电镜下粒子呈现密实的球形结构。原子力显微镜(AFM)与荧光显微镜结果显示,利用生物素-亲和素间的特异性相互作用,DNA粒子可以成功的负载到玻璃或硅片表面；基底上DNA负载密度高达935ng/cm2,比物理吸附的高3倍。通过特异性相互作用固定的DNA粒子具有缓释作用；当加入过量自由生物素分子时,大量的DNA会从基底表面释放出来。在自由生物素存在的条件下,固定了DNA粒子的基底材料的转染效率达6.6%,远高于对照组。 本文基于纤维蛋白原分子中knob-hole间的特异性相互作用,构建了原位自组装水凝胶体系。成功的将knob多肽接枝到了透明质酸(HA)分子上,接枝率为18.72%。通过调节Knob-g-HA与纤维蛋白原的用量比,发现当knob:hole=1.2:1时,该体系可以形成原位自组装水凝胶。扫频流变结果显示,当knob:hole=1.2:1时,混合体系的储存模量始终大于损耗模量,且随着纤维蛋白原浓度的提高,储存模量逐渐增大且变化幅度较为平稳。SEM结果显示,水凝胶呈现织状微观结构,具有良好的贯通性。水凝胶溶胀曲线显示,该体系的溶胀速率与溶胀度均高于蜂窝状结构的对照组,溶胀率为270%。细胞实验结果显示,该体系对NIH-3T3细胞具有较低的毒性。 基于上一节对knob-hole司特异性相互作用的初步了解,进一步考察该作用在制备基因活性水凝胶材料中的应用。研究发现,当N/P=10,DNA浓度为62.5μg/mL、纤维蛋白原浓度为50mg/mL,可以制备基于knob-hole特异性相互作用的以基因纳米粒子为交联点的纤维蛋白原/透明质酸水凝胶,且可以在毫米级保持形状。由浊度法检测该体系的凝胶时间约为5-10min,水凝胶具有贯通的多孔性微观结构,DNA以纳米粒子的形式均匀的分布在水凝胶中,DNA释放速率较为缓慢,释放时间达35天。包封在该体系中的细胞,随着培养时间的延长,生长速率呈现先增加后减小的趋势。同时发现,该基因活性水凝胶与细胞共培养3d后可以实现基因的有效转染,且转染的细胞大都集中在细胞聚集体中。
【关键词】：特异性相互作用 基因活性 生物素-亲和素 基因转染 纤维蛋白原 knob-hole 水凝胶
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 致谢6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-15
• 1 引言15-38
• 1.1 组织工程概述15-16
• 1.2 组织工程三要素16-21
• 1.2.1 支架16-18
• 1.2.2 种子细胞18-19
• 1.2.3 生物活性信号及其传递19-21
• 1.3 基因活性组织修复材料21-26
• 1.3.1 基因治疗在组织工程中的应用22
• 1.3.2 基因负载形式22-26
• 1.4 特异性相互作用及其在基因活性支架中的应用26-36
• 1.4.1 特异性相互作用概述27-28
• 1.4.2 特异性相互作用在材料制备中的应用28-29
• 1.4.3 生物素-亲和素特异性相互作用及其应用29-31
• 1.4.4 纤维蛋白原交联机理及knob-hole特异性相互作用31-36
• 1.4.4.1 纤维蛋白原概述31
• 1.4.4.2 纤维蛋白原应用领域31-34
• 1.4.4.3 纤维蛋白原聚合机理34-36
• 1.5 课题的提出36-38
• 2 基于生物素-亲和素特异性相互作用的二维基因活性体系的构建38-50
• 2.1 实验部分38-42
• 2.1.1 主要原料与试剂38-39
• 2.1.2 生物素化聚乙烯亚胺(B-PEI)的制备39
• 2.1.3 B-PEI/DNA复合粒子的制备与性能39-40
• 2.1.4 生物素化基底的制备40
• 2.1.5 B-PEI/DNA复合粒子在生物素化基底表面的负载40-41
• 2.1.6 DNA释放行为41
• 2.1.7 HEK 293细胞培养41
• 2.1.8 细胞毒性41
• 2.1.9 细胞转染性能41-42
• 2.1.10 统计分析42
• 2.2 B-PEI的表征42-43
• 2.3 B-PEI/DNA复合粒子理化性能表征43-44
• 2.4 生物素化基底材料的表征44-45
• 2.5 B-PEI/DNA复合粒子在生物素化基底表面的负载45-46
• 2.6 B-PEI/DNA复合粒子的释放行为46-47
• 2.7 细胞毒性47-48
• 2.8 基因转染性能48-49
• 2.9 本章小结49-50
• 3 基于knob-hole相互作用的自组装水凝胶的制备及性能50-60
• 3.1 实验部分50-53
• 3.1.1 主要原料与试剂50-51
• 3.1.2 甲基丙烯酸酯化的透明质酸(MeHA)、多肽修饰的透明质酸(Knob-g-HA)的制备与表征51
• 3.1.3 水凝胶形成条件的探索51-52
• 3.1.4 水凝胶的机械性能表征52
• 3.1.5 水凝胶微观结构的表征52
• 3.1.6 水凝胶的溶胀性能测试52-53
• 3.1.7 细胞培养53
• 3.1.8 统计分析53
• 3.2 MeHA、Knob-g-HA的核磁表征结果53-55
• 3.3 水凝胶的形成55
• 3.4 水凝胶的流变行为55-56
• 3.5 水凝胶的微观结构56-57
• 3.6 水凝胶的溶胀动力学57
• 3.7 细胞毒性57-59
• 3.8 本章小结59-60
• 4 基于knob-hole相互作用的原位自组装基因活性水凝胶的制备及性能60-71
• 4.1 实验部分60-63
• 4.1.1 主要原料与试剂60-61
• 4.1.2 DNA/PEI/Fibrinogen复合粒子的制备与表征61
• 4.1.3 DNA/PEI/Fibrinogen复合粒子为交联点的水凝胶体系的制备61
• 4.1.4 凝胶动力学表征61-62
• 4.1.5 水凝胶的微观结构62
• 4.1.6 DNA粒子在水凝胶中的分布情况62
• 4.1.7 DNA释放行为62
• 4.1.8 细胞培养62
• 4.1.9 细胞毒性62
• 4.1.10 基因转染性能62-63
• 4.1.11 统计分析63
• 4.2 DNA/PEI/Fbrinogen复合粒子的制备与理化性能的表征63-64
• 4.3 水凝胶的形成64-65
• 4.4 水凝胶凝胶动力学65
• 4.5 基因活性水凝胶的微观结构65-66
• 4.6 DNA粒子在水凝胶中的分布66-67
• 4.7 DNA释放行为67-68
• 4.8 细胞毒性68-69
• 4.9 基因转染性能69
• 4.10 本章小结69-71
• 全文总结71-72
• 建议与展望72-74
• 参考文献74-84
• 作者简介84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 赵剑英;李玉邯;郭海全;高连勋;;生物芯片表面氨基密度检测及稳定性研究[J];分析化学;2006年09期

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本文编号：1113186