利用SD大鼠脂肪间充质干细胞体外构建成骨细胞膜片、血管内皮细胞膜片的研究

发布时间：2017-11-06 01:20

  本文关键词：利用SD大鼠脂肪间充质干细胞体外构建成骨细胞膜片、血管内皮细胞膜片的研究

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【摘要】：目的:利用SD大鼠脂肪间充质干细胞体外诱导分化培养,获得具有成骨、成血管潜能的双细胞膜片,为血管化组织工程骨的构建提供部分实验依据和理论基础。方法:取SD大鼠附睾及背侧脂肪组织,0.1%Ⅰ型胶原酶消化分离获得脂肪间充质干细胞(ADSCs),传代培养以获得较为纯净的ADSCs。流式细胞术鉴定其表面分子CD29、CD44、CD31、CD45的表达;分别向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色定性检测其多项分化能力。将ADSCs以1x10~6/cm~2密度接种,用成骨诱导分化培养基(含50μg/ml抗坏血酸)持续培养,观察膜片的形成过程和形成情况,将获得的细胞膜片行SEM、TEM、HE及vonkossa染色检测其成骨性能。利用内皮细胞培养基(EGM-2)(含50ng/ml VEGF)将ADSCs体外向内皮细胞诱导分化,诱导14-21天后,流式细胞术鉴定细胞表面分子CD44、CD29、CD31、CD34;Matrigel基质胶检测内皮细胞体外成血管功能。将ADSCs以1x10~6/cm~2密度接种,用EGM-2培养基(含50μg/ml抗坏血酸和50ng/ml VEGF)持续培养,观察膜片的形成过程和形成情况,将获得的细胞膜片行HE染色、TEM及免疫荧光CD31染色检测其成血管性能。结果:原代ADSCs呈短梭形及多角形,培养3代后,细胞呈均一的长梭形。流式细胞术鉴定显示ADSCs高度表达CD29、CD44,基本不表达CD31、CD34。将ADSCs分别向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导分化,染色定性检测显示油红O染色阳性;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,alp)alp染色、茜素红染色、vonkossa硝酸银染色阳性;阿利新蓝染色阳性。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接种于成骨诱导分化培养基(含50μg/ml抗坏血酸)中持续培养,14天后可成功获得细胞膜片。HE染色见膜片由大量成骨细胞及细胞外基质构成;扫描电镜显示细胞被自己所分泌的细胞外基质包埋,基质中可见大量矿化结节聚集;透射电镜显示细胞外基质内针状钙盐结晶沉积;Vonkossa硝酸银染色阳性,这些结果均表明该膜片具有潜在的成骨能力。ADSCs以高密度(1×10~6/cm~2)接种于EGM-2培养基(含50μg/ml抗坏血酸、50ng/ml VEGF)中持续培养,16天后可成功获得细胞膜片。HE染色可见膜片由大量内皮细胞及细胞外基质构成;透射电镜显示细胞内可见内皮细胞特殊结构Weibel-Palade小体;免疫荧光CD31染色阳性,这些均表明该膜片具有潜在的成血管能力。结论:1.大鼠脂肪间充质干细胞可以定向分化为成骨细胞,高浓度持续成骨细胞诱导培养后可获得细胞膜片,且该膜片可能具有潜在的成骨能力。2.大鼠脂肪间充质干细胞可以定向分化为内皮细胞,高浓度持续成内皮细胞诱导培养后可获得细胞膜片,且该膜片可能具有潜在的成血管能力。3.分别获取脂肪间充质干细胞来源的具有成骨能力的细胞膜片及成血管能力的细胞膜片,为血管化组织工程骨的构建奠定一定的实验依据和理论基础。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318

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