软骨细胞与静电纺丝PCL支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究

发布时间：2017-11-08 13:16

  本文关键词：软骨细胞与静电纺丝PCL支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究

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【摘要】：先天性缺陷、退行性疾病（骨性关节炎）和创伤都会造成关节软骨的损伤。由于缺乏血管供应、神经支配以及淋巴回流，关节软骨损伤后的修复再生能力极弱。传统的外科治疗包括骨膜移植术、自体软骨移植术和骨髓刺激术等，但都存在临床预后差、可修补范围有限、组织功能低下及疾病传播风险等缺陷。软骨组织工程技术通过联合细胞治疗（软骨细胞、成人干细胞）、合适的生物材料支架（天然材料、人工合成材料）以及多种生长和分化刺激因子，构建出功能化的体外软骨组织并最终移植至缺损部位，为解决软骨损伤难题带来了希望。 种子细胞及支架选取是组织工程研究领域的重要内容，，不同的种子细胞在不同的支架生长表现出不同的生物学特性。软骨细胞作为种子细胞已广泛应用于三维支架和生物反应器研究中。静电纺丝技术（Electrospinning）（简称“电纺”）可以制造出微米级和纳米级的纤维多孔支架，纤维精细度高，与天然细胞外基质（Extracellular Cell Matrix, ECM）纤维形态及分布相似，且孔隙率高、表面积体积比大，在组织工程支架制造领域具有良好的应用前景，并广泛开展于骨、软骨、血管和神经组织再生研究。聚已内酯（Polycarpolaction, PCL）作为生物相容性及生物可吸收性好的人工合成生物材料，在越来越多的组织工程研究中使用，包括软骨组织工程。 力学刺激是关节软骨生长发育的必备条件，种子细胞缺乏力学刺激，分泌软骨ECM的能力会很弱。动态的培养环境可以促进营养物质和代谢废物的运输循环，提高细胞的增殖和ECM合成能力。ECM维持着软骨的结构和功能，因而细胞生物力学的研究越来越受到重视。各种生物反应器（Bioreactor）的研发和使用提供了仿生的力学刺激。灌流培养生物反应器（Flow perfusion bioreactor）将带有分化因子的培养基液体持续循环通过支架-细胞复合物，同时提供了剪切力和流体压力刺激，模仿了天然活动关节的力学环境。 由于本身所特有的结构和机械特性，静电纺丝支架联合生物反应器的研究较少。静电纺丝支架的纤维直径、孔径和孔隙率等结构参数都影响着局部力学环境的建立。在灌流生物反应器中，灌流速率的设置是影响力学刺激施加的独立参数，因而不同结构参数的静电纺丝支架加载于不同灌流速率的灌流反应器中会带来不同的力学刺激，从而影响着细胞的活性及功能。探寻能够维持细胞活力并提供最佳力学刺激的灌流速率一直是灌流培养研究的目标。 近年来学者们一直尝试灌流生物反应器和静电纺丝支架联合应用于软骨组织工程中，并取得了一定的成果。但如何设计制造出最匹配静电纺丝纤维膜的灌流生物反应器，以及如何优化静电纺丝支架结构参数和灌流速率以达到最佳培养效果等问题仍值得探入探讨和研究。 目的：本研究自行设计制造灌流生物反应器，利用静电纺丝技术构建微米级大孔径PCL纤维多孔支架，提取原代兔软骨细胞后接种于PCL支架并加载灌流培养。观察灌流培养对静电纺丝PCL支架中兔软骨细胞增殖活性及ECM基质合成能力的影响，验证自制生物反应器的可行性，寻求静电纺丝技术和灌流生物反应器的结合，并为下一步优化生物反应器规格、灌流速率和静电纺丝支架结构参数，探讨其对组织工程软骨的影响规律提供基础和经验。 方法：利用静电纺丝技术构建微米级纤维大孔径PCL支架，行扫描电子显微镜（Scanning electron microscope, SEM）观察支架表面形态，ImageJ软件计算纤维直径和孔径；自行设计制造灌流生物反应器，控制灌流速率为0.5mL/min；分离培养新西兰纯种大白兔膝关节软骨细胞（chondrocytes）并体外扩增至第三代（Passage3, P3），接种支架后分为灌流加载培养组（Perfusion group）和静态培养组（Static group）。在培养第3、7、14天收获支架-细胞复合物（Constructs），行SEM观察细胞粘附生长情况；DNA定量检测细胞增殖活性；糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAG)定量、总胶原（Collagen, COL）定量检测软骨特异ECM分泌能力；培养第14天行Real-time PCR验证成软骨基因collagenⅡ、collagenⅠ、aggrecan基因表达情况；培养第14天行冰冻组织切片苏木精-伊红（HE）染色和番红O（Safranin O）染色观察软骨特异ECM分泌情况。 结果：SEM观察静电纺丝PCL支架纤维直径1.67±0.76μm，孔径17.65±7.11μm；自制灌流生物反应器密封性好，灌流速率精确稳定，可重复组装使用及高压灭菌处理，无生物学毒性；SEM观察支架-细胞复合物，可见静电纺丝PCL支架中软骨细胞粘附生长良好，且灌流培养组增殖快于静态培养组，较好的保持了软骨细胞特征的圆形形态。在培养第7天，灌流培养组DNA定量为11.41±4.06μg/mL，高于静态培养组3.67±1.08μg/mL（P0.05）；在培养第3天和第7天，灌流培养组GAG定量为0.6097±0.1504μg/mL和1.9289±0.6256μg/mL，高于静态培养组0.1253±0.0377μg/mL和0.1669±0.0566μg/mL（P0.01）；在培养第14天，灌流培养组GAG定量为1.2666±0.3763μg/mL，高于静态培养组0.3566±0.0855μg/mL（P0.05）。在培养第3天和第7天，灌流培养组COL定量为0.084±0.0208μg/mL和0.1133±0.028μg/mL，高于静态培养组0.0402±0.0033μg/mL和0.0433±0.0142μg/mL（P0.05）。在培养第3天，灌流培养组GAG/DNA比值为0.1747±0.0186，高于静态培养组0.0708±0.0184（P0.01）；在培养第7天和第14天，灌流培养组GAG/DNA比值为0.1488±0.0313和0.0732±0.0116，高于静态培养组0.0449±0.0029和0.0448±0.0101（P0.05）。在培养第14天，灌流培养组collagenⅡ、aggrecan基因表达增加（P＜0.05）；软骨分化指数（collagenⅡ/collagenⅠ）高于静态培养组（P＜0.05）。在培养第14天的冰冻组织切片HE染色可见灌流培养促进了细胞的渗透生长及增殖能力，番红O染色可见灌流培养提高了软骨ECM的分泌，并可观察到软骨陷窝样结构。 结论：自制灌流生物反应器与静电纺丝PCL支架联合培养软骨细胞具有可行性，促进了软骨细胞的增殖和基质的分泌，提高了组织工程软骨的质量。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】

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1 朱雷;吕丹;孙明林;;不同环境刺激对骨髓间充质干细胞成软骨分化作用的研究进展[J];中国矫形外科杂志;2010年19期

2 薛正翔;李敏;;血管组织工程支架研究进展[J];中国修复重建外科杂志;2009年09期

3 胡旭栋;王光林;;静电纺丝纳米纤维支架在神经组织工程中的研究进展[J];中国修复重建外科杂志;2010年09期

本文编号：1157289