柞蚕丝素蛋白的阳离子化及其用作基因载体的初步研究

发布时间：2017-11-24 06:12

  本文关键词：柞蚕丝素蛋白的阳离子化及其用作基因载体的初步研究

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【摘要】：促进微血管网络的再生，提高支架的成活率，是皮肤真皮等含血管组织的再生修复领域需要亟待解决的关键问题。将分子生物学和组织工程技术相结合用促进血管再生的生长因子基因转染细胞，使相应的生长因子得到稳定、高效表达，是促进血管再生的有效途径。VEGF165和Ang-1是两种最重要的且仅以血管内皮细胞为靶细胞的促血管再生生长因子。研究证明联合使用Ang-1和VEGF165双基因既有利于相互协调共同促进血管的形成，，又可使新生血管获得持久稳定的结构。寻找合适的可降解性生物材料作为基因传递载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗血管再生及皮肤组织工程等领域共同关注的问题。 柞蚕丝素是一种低免疫原性的物质，能被完全降解成多肽和游离氨基酸。柞蚕丝素蛋白含有细胞特异性黏附RGD序列，且含有较多的带极性侧链的氨基酸残基能够作为化学改性的潜在反应位点，这些优点及特性为柞蚕丝素蛋白作为基因载体的可行性提供了物质基础。 本文用精胺对柞蚕丝素蛋白进行化学修饰，使改性后的柞蚕丝素蛋白在生理环境下带正电荷，得到阳离子化的柞蚕丝素蛋白(CASF)。并以阳离子化的柞蚕丝素蛋白作为VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒的传递载体。 首先通过碳化二亚胺法(EDC)使精胺接枝于柞蚕丝素蛋白。Zeta电位分析结果表明，经精胺改性后，相同pH条件下水溶液中柞蚕丝素蛋白的Zeta电位从负值上升到7.92，当精胺与柞蚕丝素的质量比大于8%后，丝素的Zeta电位上升幅度减小。红外吸收光谱显示精胺与柞蚕丝素蛋白中羧基反应，生成酰胺键。三硝基苯磺酸法(TNBS)证实了修饰过后的柞蚕丝素蛋白中伯氨基含量有所增加。并且精胺改性后，柞蚕丝素蛋白的分子构象发生了无规卷曲和α-螺旋结构向β-折叠结构的明显转变。 其次采用碱裂解法提取质粒DNA，并通过静电吸附制备阳离子化丝素/DAN复合物。研究结果表明，阳离子化的柞蚕丝素能与DNA形成带正电的复合物，并且形成的复合物为紧密的颗粒状，粒径分布在100-500nm。 最后MTT法检测复合物的细胞相容性，研究结果表明用阳离子化的柞蚕丝素包被质粒DNA比用PEI包被质粒DNA的细胞毒性小。激光共聚焦显微镜(LSCM)和流式细胞仪检测GFP阳性细胞比率结果表明，阳离子化的柞蚕丝素蛋白可以作为VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒的传递载体，并且C8-ASF/DNA(48:1)组的复合物转染L929细胞与hy.EA926细胞的转染效率分别为15.28%，32.88%，均明显高于PEI/DNA组的转染效率。 通过本文的研究，首次使用阳离子化的柞蚕丝素蛋白共同作为VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒的传递载体转染成纤维细胞、血管内皮细胞，研究结果表明阳离子化的柞蚕丝素蛋白可以用作基因传递载体，为组织工程及原位组织再生领域的血管再生提供了一种新的基因传递载体。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

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本文编号：1221278