负载TGF-β3、BMP-2缓释微球的DBM诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的研究

发布时间：2017-12-12 18:08

本文关键词：负载TGF-β3、BMP-2缓释微球的DBM诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的研究

【摘要】：[目的]找到滇南小耳猪骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)高效扩增的方法,以更好地获取软骨组织工程种子细胞；探讨TGF-β3(Transforming growth factors, type beta3)和BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)联合体外诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的作用。 [方法](1)用骨穿针于髂后上棘抽取滇南小耳猪骨髓,采用离心加贴壁培养法培养BMSCs并鉴定。流式细胞仪检测第二代BMSCs的表面标志物CD29、CD44、CD45。并取第二代BMSCs作成骨和成软骨诱导,用茜苏红染色法检测成骨方向分化的能力,甲苯胺蓝染色检测成软骨分化的能力。 (2)取第二代滇南小耳猪BMSCs,于体外用不同生长因子不同分为4组：A组(实验组)：培养液中加入TGF-β3和BMP-2; B组(实验对照组)：培养液中加入TGF-β3; C组(实验对照组)：培养液中加入BMP-2; D组(实验空白对照组)：培养液中不加入任何生长因子；2天换液1次,倒置显微镜下观察细胞形态变化并用MTT法测定各组的生长增殖曲线。诱导14、21天后细胞通过软骨特征性染色,即Ⅱ型胶原免疫组化学染色测定BMSCs Ⅱ型胶原表达情况,第21天行Western blot检测BMSCs Ⅱ型胶原蛋白表达情况。结果数据输入SPSS17.0软件进行处理,采用单因素方差分析行统计学处理,以a=0.05为检验水准,P0.05为有统计学意义。 [结果](1)BMSCs细胞形态均为梭形生长,呈成纤维细胞样形态。 (2)流式细胞检测P2CD29阳性率为99.41%,P2CD44阳性率为99.52%,P2CD45阴性率为99.93%。 (3)BMSCs经成骨诱导2周、3周后茜苏红染色均为阳性。(4)BMSCs经成软骨诱导3周后甲苯胺蓝染色为阳性；(5)加入细胞因子的实验组及实验对照组在14、21天软骨特异性Ⅱ型胶原检测中均有不同程度的阳性表达,空白对照组D组未见阳性表达,Ⅱ型胶原免疫组化灰度值实验组较实验对照组和空白对照组表达量高,差异有统计学意义(P0.05)。21天行Western blot检测示Ⅱ型胶原蛋白灰度值实验组较实验对照组和空白对照组表达量高,差异有统计学意义(P0.05)。 [结论](1)采用离心加贴壁法培养滇南小耳猪BMSCs是一种高效扩增的方法; (2)第二代滇南小耳猪BMSCs纯度高,有多分化潜能,且能向软骨分化； (3)TGF-β3、BMP-2联合诱导更能促进BMSCs向软骨细胞诱导分化,并能促进Ⅱ型胶原的表达,TGF-P3和BMP-2可作为细胞因子更好地诱导BMSCs向软骨分化。 [目的]探索制备负载TGF-β3和BMP-2缓释微球的脱钙骨基质(Demineralized bone matrix,DBM)支架材料并探索其体外诱导BMSCs成软骨作用,为软骨缺损修复支架材料提供实验依据。 [方法](1)根据Urist描述的方法制得DBM,扫描电镜观察DBM的超微结构。采用乳化交联法制备TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球并应用扫描电镜、image软件检测微球形态,ELISA夹心法测定微球载药量、包封率及体外药物缓释率。取制备好的TGF-β3、BMP-2壳聚糖微球与第二代BMSCs体外复合培养,培养21天后,提取细胞行Ⅱ型胶原免疫组化学染色和Western blot测定Ⅱ型胶原表达情况。 (2)采用超声波法将负载TGF-β3和BMP-2壳聚糖微球与DBM支架复合,将第二代滇南小耳猪BMSCs置于复合支架中立体培养。MTT法测定BMSCs在复合支架上生长增殖曲线。根据支架材料负载因子不同分为分为3组：A组(实验组)：双因子微球/DBM复合支架组；B组(实验对照组)：空白微球/DBM支架组；C组(空白对照组)：单纯DBM组；2天换液1次,体外复合培养3周取材,并制石蜡切片行HE染色,阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化组织学观察。 [结果](1)DBM支架材料外观均呈白色海绵状,SEM观察DBM具有三维天然网状结构； (2)壳聚糖缓释微球平均粒径53.38μm,球形良好,球体均匀表面光滑,具有较高的包封率,TGF-β3和BMP-2分别为58.7%、53.2%,载药量分别为22.01ng/mg.17.55ng/mg,药物释放试验表明TGF-β3和BMP-2可以从微球中缓慢释放,第7天累积释放量达61%、57.5%; (3)以超声震荡法灌注微球进入DBM,微球能均匀地分布于DBM内且BMSCs能在复合支架上附着生长并增殖; (4)负载双因子微球和BMSCs复合培养21天后免疫组化和Western blot检测Ⅱ型胶原均为阳性； (5)复合培养3周后,取出型组织学切片观察：HE染色见核染色呈蓝色,可见软骨细胞样细胞增生；阿利新蓝染色见支架周围基质染为蓝色;Ⅱ型胶原免疫组化见细胞包浆和基质中出现棕黄色颗粒,染色阳性。对照组染色均为阴性或弱阳性。 [结论](1)DBM具有三维天然网状结构和良好的细胞相容性,BMSCs在复合支架上复合培养8天时达到峰值； (2)乳化交联法制备壳聚糖微球,工艺简单,重复性良好,粒径分布均匀,具有良好的缓释性能； (3)将BMSCs复合微球/DBM支架材料能诱导BMSCs向软骨分化,可应用与软骨组织工程支架材料。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08

【参考文献】

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