血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响

发布时间：2017-12-15 00:23

  本文关键词：血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响

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【摘要】：目的:从大鼠腹股沟脂肪中提取培养脂肪基质干细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs),鉴定其生物学特性;构建高表达血红素氧化酶1(Heme oxygenase1,HO-1)的慢病毒表达载体,包装病毒后转染ADSCs,建立ADSCs-HO-1模型;体外研究HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响,以及对周围细胞的募集作用,并探讨其在骨组织工程中的应用策略。方法:1.胶原酶消化脂肪获取细胞后,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养ADSCs,接种于培养基中进行培养传代。通过观测其形态特点、流式细胞技术鉴定其表面标志和多功能分化潜能(成脂分化和成骨分化)鉴定培养细胞为脂肪基质干细胞;2.从携带有目的基因HO-1的载体Puc57上克隆目的基因序列,通过酶切、酶连,将其连入慢病毒表达载体p Zs G中,再将连接成功的表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α,经菌落PCR鉴定连接结果,扩增提取该表达载体。将携带目的基因的慢病毒表达载体与另外三个慢病毒包装载体在293T细胞中包装,分别于48h和72h收集慢病毒液。在8μg/ml的转染试剂Polybrene条件下转染ADSCs,建立ADSCs-HO-1模型,western blot验证转染结果;3.将细胞分为四组:ADSCs转导HO-1组(A组)、ADSCs转导空载体组(B组)、ADSCs未转导组(C组)和ADSCs转导HO-1组加锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin,Sn PP)(D组)。采用MTT、流式细胞仪分析凋亡率探讨HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响;通过q RT-PCR检测骨标志物和钙基质染色分析HO-1修饰的ADSCs对其自身成骨分化情况;划痕实验和transwell观察HO-1高表达对ADSCs募集作用的影响。结果:1.体外成功分离培养出大鼠ADSCs,形态呈长梭形,具有成骨、成脂分化潜能,经鉴定第2代贴壁细胞阳性表达CD29(99.3%)、CD44(70.7%)、CD90(52.0%),阴性表达CD45(3.73%)和CD31(6.58%);2.构建高表达HO-1的慢病毒表达载体p Zs G-HO-1,菌落PCR证实HO-1片段连入表达载体,包装慢病毒后转染ADSCs,western blot检测HO-1蛋白在ADSCs中高表达;3.①MTT连续1周检测A和B组细胞活性,第2天测定A组较B组活性增高,差异有统计学意义(p0.05)且持续一周;②流式分析细胞凋亡率显示,A组细胞凋亡率为41.3%±3.34%,较B组(58.7%±4.25%)和C组(55.3%±4.50%)明显降低,差异有统计学意义(p0.05),且Sn PP可增加A组细胞的凋亡率(70.7%±4.01%);③q RT-PCR测得细胞成骨分化第7天时,ALP和Runx2升高,差异有统计学意义(p0.05),ColⅠ和OCN未见明显差异;第14天时,ALP、Runx2、ColⅠ和OCN均较第7天升高,差异有统计学意义(p0.05);第21天时,茜素红和von kossa均证实,HO-1高表达可提高ADSCs钙结节形成。④划痕实验显示A组细胞迁移率69.3%±3.8%,较B组(31.5%±8.4%)和C组(32.8%±8.6%)明显增加,差异有统计学意义(p0.05);transwell实验证实,A组上清可增加细胞迁移的数量,且这种效应可被HO-1活性抑制剂Sn PP抑制。结论:1.密度梯度离心联合贴壁方法简单、可以大量体外扩增ADSCs,具有多向分化潜能,表达间充质干细胞表面标记物,无内皮细胞和白细胞混杂。2.成功构建高表达HO-1的慢病毒表达载体和ADSCs-HO-1模型。3.HO-1高表达在无HO-1活性抑制剂存在的前提下,可提高ADSCs增殖活性、抗凋亡能力、促进ADSCs成骨分化和提高ADSCs募集能力。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687;R318.08

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