自体组织化膨体聚四氟乙烯抗感染能力的实验研究

发布时间：2018-01-09 10:06

本文关键词：自体组织化膨体聚四氟乙烯抗感染能力的实验研究　出处：《第三军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的：生物材料广泛应用于各个领域,临床常见的软组织填充材料主要有膨体聚四氟乙烯(expended polytetrafluoroethylene, ePTFE)、硅橡胶(silicone rubber, SR)、羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)、高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE)等膨体聚四氟乙烯(expanded polytetrafluoroethylene, ePTFE)是常用于临床的高分子软组织填充材料之一,质地软,含微孔(直径平均长度50μ m),允许细胞、组织长入,组织粘附性强,生物相容性佳,是一种理想的软组织充填人工材料,由于血管、组织可在材料内部生长,因此其手术远期固定效果好,形态自然,而其缺点是质地软,内部结构受压后易变形,血管组织不易长入材料内部,且长期与周边组织摩擦力的作用下产生颗粒、微屑,容易引发慢性感染。整形外科手术术前消毒是无法完全将鼻腔、耳部藏匿的细菌彻底清除,因此容易将细菌带入术区,常见的病原菌为定居在人体皮肤和粘膜表面的条件致病菌,又称机会致病菌,当其集聚部位改变、机体抵抗力降低或菌群失调时则可致病,条件致病菌常伴随生物材料的植入长期驻入体内,其中尤以表皮葡萄球菌常见,表皮葡萄球菌入侵至材料表面,首先经历一个动态可逆吸附和不可逆粘附过程,细菌在材料表面生长、繁衍,同时材料表面能吸附组织、细胞分泌的黏连蛋白、细胞外基质,人体组织细胞分泌物与细菌混合形成水合多聚糖生物膜,该膜能保护内部细菌抵抗宿主免疫机制及抗生素的作用,从而抗生素无法彻底清除细菌,又能促进细菌进一步粘附,且膜内细菌代谢率降低,在能量供给不足的情况下可长期存活,甚至部分细菌因此逃脱人体免疫机制,长期潜伏于细胞内,所以生物膜内游离或释放出来的细菌进入组织和血液便成为慢性感染源。另外,相对于正常组织,生物材料作为异物植入体内可降低诱发感染的最低细菌数量,从而容易导致感染。临床上,人体某些部位如鼻部、耳部皮肤厚度薄,材料植入后组织容易缺血、坏死,假体外露发生率的风险大大增加,如ePTFE感染外露率8-10%, medpor材料植入耳支架再造术后3-6个月期间易发生慢性感染,材料外露率达到16.22-20%,经过颞筋膜瓣加游离植皮包裹支架等诸如此类的手术改良法,材料外露的病例仍然常见。目前生物材料表面改性是常见而有效的手段,主要包括化学法(表面化学接枝、耦合接枝、化学浸渍),物理法(高能辐射线、紫外光辐照、低温等离子体),生物法(蛋白涂层、生物表面修饰工程)等,方法众多,仍受经济、技术、原材料等多方面因素制约。如何提高生物材料抑制细菌粘附的能力,预防细菌生物膜的形成及改善其生物相容性是目前生物材料改良技术研究的热点。在组织工程学中,生物医用材料支架通过细胞体外培养或构建修复器官、组织,最后植入体内与机体周围结缔组织及血管相结合,本课题组考虑将生物材料植入动物体内较体外更易培养细胞组织,因此提出“材料自体组织化”的概念,即将材料预先放入机体皮下血供较丰富的深部组织,埋植一段时间后,机体血管组织长入并填满材料内部孔隙,形成一个携带微血管循环结构、结缔组织、细胞因子等物质的复合物。具体方法是将ePTFE预先在大鼠自体体内埋植,让血管和组织向微孔内适度生长,分别在4、8、12周观察材料与自身结缔组织血管结合长入情况,确定材料与组织融合最佳状态的时间点,取出最佳融合状态的复合物,再次行手术将其转移至靶向埋植部位,且术中伤口内注入细菌,通过肉眼观察、HE染色、电镜观察及细菌粘附量计数评价自体组织化ePTFE抗感染能力及相关组织学的变化。研究方法：本研究分为二部分：第一部分：自体组织化膨体聚四氟乙烯的模型建立 1.无菌条件下,消毒ePTFE片备用。30只SD大鼠全身麻醉,腹部备皮,消毒铺巾,在腹部正中作长约lcm切口,逐层分离至腹膜下,形成约3cm X3cm大小潜行腔隙。将备用ePTFE片放入潜腔,切口缝合、消毒。 2.埋植时间4、8、12周。 3.分别在4、8、12周后取出材料,HE染色,步骤：①取出埋植于大鼠腹壁内ePTFE片,生理盐水冲洗3次。②将ePTFE片放入4%多聚甲醛溶液内固定24h。③70%、85%、95%、100%乙醇溶液中脱水。④二甲苯溶液透明。⑤石蜡包埋。⑥切片。⑦苏木精-伊红染色。第二部分：自体组织化膨体聚四氟乙烯抗感染能力的研究 1.30只SD大鼠随机分为3组(A、B、C组),每组10只。 2.大鼠全身麻醉,背部、腹部备皮,消毒铺巾,取出30块自体组织化ePTFE片,放入PS液中备用。 3.大鼠背部消毒铺巾,分别在两侧脊柱旁2cm处作长2.5cmx2.5cm切口,每侧切口内各注入SE菌液10μ L(含菌量105～106CFU),按随机原则背部左、右侧伤口内分别埋植自体组织化ePTFE片、ePTFE片,30处埋植ePTFE片为对照组,30处埋植自体组织化ePTFE片为实验组,伤口缝合、消毒包扎。4.炎症评价：术后1、2、4周内每天观察大鼠背部左、右侧伤口有无血肿、皮瓣坏死、感染、排斥、材料移位及脱落情况。炎症评价标准：按血肿形成的大小、皮瓣坏死百分比及植入材料脱落程度,参照Neel的分级方法分为3级：0级表示表示不存在；1级表示轻度；2级表示中度；3级表示重度或广泛血肿形成或皮瓣坏死。5.术后1、2、4周,分别依次取出A、B、C三组所有大鼠背部埋植的材料,自体组织化ePTFE片为实验组,普通ePTFE片为对照组,用无菌水清洗10次,去除材料表面未粘附上的细菌,然后放入2mL的灭菌水,混合振荡器振荡15min,彻底将已在材料表面粘附的细菌洗脱。最后,各取稀释菌液1μ L分别接种于血琼脂平板,温度37℃,放入细菌孵育箱过夜培养,计数平板生长细菌菌落个数。6.电镜(SEM)观察分别取出自体组织化ePTFE片、普通ePTFE片,PBS液冲洗,10%四氧化锇液固定,乙醇梯度脱水,乙酸异戊酯置换,自然法干燥,喷金,扫描电镜观察细菌粘附材料表面情况。研究结果 1.肉眼观察： 1.1自体组织化膨体聚四氟乙烯的模型建立 (1)ePTFE片自体组织化4周,材料周围可见透明薄膜形成,但内部并无机体血管、组织长入。 (2)ePTFE片自体组织化8周,材料周围可见较为致密透明薄膜形成,内部可见部分机体血管、组织长入。 (3)ePTFE片自体组织化12周,外周有致密透明纤维囊,内部可见大量机体微血管、组织长入,且将材料固定于周围组织中,不易取出。 1.2自体组织化膨体聚四氟乙烯抗感染能力的研究 (1)注入SE菌液术后1周,自体组织化ePTFE片与周围组织紧密牢固地结合,表面有新生血管长入材料内部,无明显炎症表现,ePTFE片与周围组织无粘连,未见明显组织、血管长入,在材料周围可见脓性、黄色黏状分泌物。 (2)注入SE菌液术后2周,自体组织化ePTFE片与周围组织紧密牢固地结合,表面有新生血管长入材料内部,无明显炎症表现；ePTFE片与周围组织基本无粘连,无组织、血管长入,材料表面附有少许淡黄色、灰白色脓性黏状分泌物,周围组织有部分坏死、积液。 (3)注入SE菌液术后4周,体内组织化ePTFE片与周围组织紧密牢固地结合,表面有新生血管长入材料内部,无明显炎症；ePTFE片与周围组织轻度粘连,未见明显组织、血管长入,材料表面淡黄色、灰白色脓性黏状分泌物有所减少,周围坏死组织结节化,瘢痕明显,伤口愈合延迟。 2.HE染色 2.1自体组织化膨体聚四氟乙烯的模型建立 (1)ePTFE片自体组织化4周,组织、细胞浸润材料内部深度约为1/3,外周逐渐形成透明、断续的薄膜。 (2)ePTFE片自体组织化8周,组织、细胞浸润材料内部深度约为1/2,外周基本可见比较完整透明薄膜。 (3)ePTFE片自体组织化12周,外周已形成一层成熟完整的透明纤维囊,其间微血管、组织填满材料孔隙内。 2.2自体组织化ePTFE抗感染能力的研究注入SE菌液术后1周,ePTFE片内部浸润大量炎症细胞,并在材料周围形成肉芽肿样组织,无血管组织长入材料内部；而自体组织化ePTFE片内部仅有少量炎症细胞浸润,组织血管已长入材料内部,与周围结构结合紧密。 3.炎症评价： (1)1周后,实验组3处0级、4处1级、3处2级、0处3级；对照组1处0级、2处1级、5处2级、2处3级。 (2)2周后,实验组8处0级、2处1级、0处2级、0处3级；对照组4处0级、5处1级、1处2级、0处3级。 (3)4周后,实验组10处0级、0处1级、0处2级、0处3级；对照组9处0级、1处1级、0处2级、0处3级。总计8例大鼠死亡,死亡率为26.7%。 4.细菌计数 (1)1周后,实验组表皮葡萄球菌粘附菌落形成单位(7.41±1.3)X107CFU/L、对照组(19.67±2.51)X107CFU/L,实验组粘附细菌数量少于对照组(P0.05) (2)2周后,实验组表皮葡萄球菌粘附菌落形成单位(3.94±1.00)X107CFU/L、对照组(8.75±1.7)X107CFU/L,实验组粘附细菌数量少于对照组(P0.05) (3)4周后,实验组表皮葡萄球菌粘附菌落形成单位(1.97±0.89)X107CFU/L、对照组(3.66±1.8)X107CFU/L,实验组粘附细菌数量均明显少于对照组(P0.05) 结论 1.ePTFE自体组织化4、8周时,组织血管长入材料内部较浅,组织、血管易与材料分离。12周时,材料紧贴腹壁,加压推挤后不会移位,材料内部有大量血管及组织紧密长入材料将其包裹,因此,ePTFE达到充分自体组织化需要12周。 2.本课题组构建的自体组织化ePTFE模型可在动物体内应用。 3.大鼠背部双侧伤口注入等量SE菌液1、2、4周,自体组织化ePTFE实验组与ePTFE对照组炎症程度比较,实验组炎症程度评分明显低于对照组。 4.大鼠背部双侧伤口注入等量SE菌液1、2、4周,自体组织化ePTFE实验组与ePTFE对照组表面粘附细菌的数量比较,实验组粘附细菌的数量明显低于对照组,且两组材料细菌粘附数量均与时间成反比。 5.自体组织化ePTFE植入靶向部位1周后即能与机体组织建立紧密联系,融合能力较ePTFE强,生物相容性佳。 6.材料自体组织化的方法对下一步在临床上medpor材料支架耳廓再造、膨体聚四氟乙烯隆鼻等手术中的推广有指导意义。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08

【参考文献】