PPy-CS和FK506表面修饰对生物材料促成骨作用研究

发布时间：2018-01-30 21:00

  本文关键词： PPy-CS 体内 生物可吸收材料 生物相容性 成骨 FK506 BMSCs 修饰 体外 成骨 FK506 BMSCs 修饰 体内 成骨　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分PPy-CS涂层表面修饰对植入物界面促骨整合能力的影响目的：评价PPy-CS涂层修饰植入物后在兔子体内生物相容性及促骨整合的能力。方法：选择17只雌性、体重在3.20±0.20kg的新西兰大白兔,将PPy-CS涂层修饰的可吸收钉及未经涂层修饰的两种螺钉及临床应用的不锈钢钉植入新西兰大白兔双侧的下肢中,每侧下肢植入一种类型螺钉,胫骨上端植入2枚钉子,股骨髁部植入1枚钉子；其中12只实验兔用作分别观察12周及26周,另外5只实验兔用作观察12周时的力学测试。通过观察实验兔术前术后的饮食、饮水、体重、体温、术后的体征、血液生化检测、安乐死后器官重量及病理检测,钉子周缘的软组织的大体观及病理检测,μ-CT检测钉子周缘的成骨情况,以及钉子进行硬组织切片检测,来明确该涂层的兼容性及在12w及26w时的在钉子周缘的促成骨能力。结果：涂层组与未涂层组实验兔均生长良好,2组在术前术后的饮食、饮水、体重、体温、术后的体征、血液生化检测、安乐死后器官重量及病理检测,钉子周缘的软组织的大体观及病理检测,钉子的硬组织切片检测等观察结果进行统计后,均未见明显的统计学意义(P0.05),说明该PPy-CS涂层应用于动物体内后,在12w及26w的观察期限内,均未见系统及局部的毒副反应；经μ-CT、扭力测试、四环素荧光检测及硬组织的甲苯胺蓝染色后发现,涂层组较未涂层组的结果在12w及26w均有统计学意义(P0.05),说明PPy-CS涂层具有较好的促成骨能力。结论：PPy-CS涂层表面修饰的生物材料,在植入动物体内12w及26w时生物相容性良好,同时具有良好的促骨整合的能力。第二部分FK506表面修饰对多孔支架成骨效能体外研究目的：体外检测缓释不同浓度FK506的多孔PLA/β-TCP支架对间充质干细胞成骨诱导作用的研究。方法：利用微米级p-TCP高能球磨法制备纳米级β-TCP (Np-TCP),将聚乳酸(PLA)与纳米β-TCP颗粒混合制得p-TCP质量百分比为30%的混合溶液(70PLA/30β-TCP),再称取不同比例的FK506加入上述溶液中,混合均匀后注入特制的聚四佛乙烯模具,冻干后制备表面修饰了不同FK506质量百分比浓度的多孔支架材料,制成统一5mmx5mmx3mm大小。利用ELISA试剂盒检测上述含不同FK506浓度的支架材料分别在0.33、0.66、1、2、6、12、24、48、96、144、336、720h时间点药物缓释情况,初步明确其药物缓释曲线。另取来自人的骨髓间充质干细胞(BMSCs)以1×106/30μl接种于不同FK506浓度的多孔支架,体外共培养2周,其中培养1周时随机取支架-细胞复合物在电镜下观察。在培养1周、2周时,分别取培养液进行OCN检测,取出复合细胞的多孔支架经研磨、裂解后进行ALP检测。结果：成功获得5种含FK506不同质量百分比(0%、2%、4%、6%、8%)的纳米级PLA/β-TCP多孔支架。获得了上述经FK506修饰的多孔支架的药物缓释曲线,6%组的FK506的释放量较其他各组均有增高。细胞-支架培养1周后电镜观察示BMSCs在多孔支架内生长良好。支架与细胞共培养1周时,5种不同浓度的多孔支架经裂解、研磨后,发现6%质量百分比的支架ALP值较其他各组高,但经统计学分析,5组间未见统计学意义；2周时,各组的ALP均值较前有增高,6%组与其他几组均有统计学意义(P0.05)。而在支架与细胞共培养后1周时,对5种不同浓度的多孔支架的培养液进行OCN检测,发现6%组OCN检测值较其他各组均有增高(P0.05)：而在2周时,6%组与8%组OCN值均较其他各组明显增高,经统计学分析,6%组与8%组均较其他3组有统计学意义(P0.05),但该两组间未见明显统计学差异(P0.05)。结论：BMSCs可以在经FK506表面修饰的纳米级多孔PLA/β-TCP内生长,6%组多孔支架有较好的药物缓释曲线,同时对该组在体外复合BMSCs后的ALP及OCN检测,初步认为6%质量百分比的经FK506修饰的N-PLA/β-TCP在体外促成骨方面可能有一定的优势。第三部分FK506表面修饰对多孔支架材料在动物体内生物相容性及促成骨效能的影响目的：探讨经FK506修饰的N-PLA/β-TCP多孔支架在动物体内生物相容性及促成骨的作用,从而结合体外实验明确最佳的FK506修饰浓度。方法：将不同质量百分比FK506分别修饰的N-PLA/β-TCP多孔支架制作成5mmx5mmx3mm大小,辐射消毒后备用。用DiI及Brdu标记人BMSCs,以1×106/30μl接种于上述5种支架材料中。在共培养2周时,将接种细胞多孔支架材料植入8只新西兰大白兔背部皮下,同时取4只作为单纯多孔支架材料的对照。于术后观察实验兔的体征、饮食、饮水、切口局部的反应等,4周和8周实验兔安乐死后取标本周边软组织进行大体观察及组织学检查,标本的大体观察、常规组织学及免疫组织化学染色观察。术后4周、8周,标本周缘的软组织行石蜡包埋,常规HE染色；所有标本一分为二切开,部分标本做冰冻切片,DAPI复染,荧光显微镜下示踪BMSCs、OCN免疫荧光及ALP免疫组化;另一部分进行石蜡包埋,行HE染色、OCN、Ⅰ型胶原免疫组化检测。结果：经FK506表面修饰的N-PLA/β-TCP多孔支架与BMSCs的复合物及该单纯多孔支架在植入新西兰大白兔背部皮下后,术后均未见明显的异常体征、饮食、饮水、体重等,手术切口处未见明显的红、肿、热或明显的包囊结构等异常表现。术后4周、8周,实验兔安乐死后,各组标本周缘的软组织大体观及组织学均未见明显的炎症等异常表现；标本荧光显微镜下观察见DiI标记的细胞存活于多孔支架中,Brdu标记的细胞可见与Brdu抗体的结合反应,进一步说明在该类型多孔支架中BMSCs可以正常存活生长。4周时,5组标本经常规HE染色及免疫组化检测后,6%组的新生编织骨量明显较其他各组均增多(P0.05),6%组的ALP、OCN、Col I等成骨指标阳性表达率经半定量评分均较其他各组有不同程度的提高(P0.05)；8周时,6%与8%组的新生编织骨量明显较其他各组均增多(P0.05),但该两组间未见统计学差异(P0.05),6%组的ALP、ColⅠ表达阳性率较其他各组高(P0.05),OCN表达较4周时增高,但与其他各组未见统计学差异(P0.05)。结论：FK506表面修饰的N-PLA/β-TCP多孔支架与BMSCs有良好的生物相容性,其中FK506质量百分比为6%的多孔支架在动物体内的促成骨方面更具优势。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08

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本文编号：1477220