应用微构重塑技术体外构建厘米级工程化骨组织的实验研究

发布时间：2018-02-22 03:14

本文关键词： 骨组织工程微构重塑技术微组织人羊膜来源间充质干细胞成骨分化　出处：《华东理工大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基于传统技术体外构建的工程化组织,由于物质传递受限使得三维构建物中细胞和胞外基质分布不均,细胞主要生长在支架的表层区域,构建物内部因氧和营养物质供给不足、细胞代谢副产物难以排出而出现坏死区,无法形成尺寸突破厘米级的工程化组织,远不能满足临床的需要。组织微构重塑技术是指通过制备模拟体内组织结构功能单位的微组织并将其装配形成工程化组织的一项新技术,为解决体外构建大尺寸工程化组织提供了新思路。本文以体外构建工程化骨组织为研究对象,从降低或消除工程化组织体外构建过程中的传质限制出发,重点研究基于人羊膜来源间充质干细胞(hAMSCs)体外扩增和定向诱导分化的组织微构重塑技术,以建立厘米级大型骨组织的体外构建技术和方法,为未来大型组织替代物的体外构建和临床应用奠定基础。首先,建立了在转瓶中应用CultiSpher S微载体培养和扩增hAMSCs的悬浮培养体系,并考察了微载体种类、细胞接种密度、搅拌转速和微载体浓度等对细胞在微载体上生长和代谢的影响。实验结果表明,CultiSpher S微载体更适合支持hAMSCs生长；当细胞接种密度为0.5×105cells/ml、搅拌转速为50 r/min、微载体浓度为2.0 mg/ml时,hAMSCs在微载体上增殖8d后进入稳定期,最高细胞密度可达(29.6±3.7)×106cells/cm3,最大扩增倍数达到14.7士1.8。在此基础上,采用该培养方法建立了集干细胞生长扩增和成骨诱导分化为一体的骨微组织制备技术。研究结果表明,接种后细胞在生长阶段增殖迅速,至8d时细胞约扩增15倍,最大细胞密度可达(29.3±2.2)×106cells/cm3。更换成骨诱导培养基诱导20 d后细胞中碱性磷酸酶活性及钙沉积量显著增加。通过细胞生长-分化二段式培养后,hAMSCs可成功在Cultishpher S微载体上扩增分化并形成具有成骨表型的微组织,可作为构建单元用于下一步工程化组织的构建。利用自制的灌注培养装配装置,将骨微组织塑形并灌注培养7d后形成了直径2.0 cm、厚度1.0 cm的圆柱状组织。该工程化组织表面基质分泌丰富,微组织结合紧密；组织内部活细胞分布均匀,但微组织之间结合较疏松,其间的空隙未被细胞和胞外基质完全填充；检测显示该组织可表达成骨分化表型。由此可见,基于组织微构重塑技术体外构建厘米级工程化骨组织是完全可行的。为了提高工程化组织中的细胞密度,促进胞外基质分泌,提高其组织的完整性和成骨特性,本文在组织制备过程中考察了小分子化合物抗坏血酸盐和巯基乙醇添加浓度对hAMSCs生长、基质沉积和成骨分化的影响。结果显示,孔板生长培养基中添加的抗坏血酸盐对hAMSCs生长有抑制作用,且随着抗坏血酸盐浓度的增加,其抑制作用增强。但添加巯基乙醇能使细胞生长较快进入稳定期,且当巯基乙醇添加浓度为50～100 μmol/L时可显著促进hAMSCs增殖。在成骨定向诱导分化阶段,抗坏血酸盐的添加浓度大于或等于100 μg/ml时hAMSCs成骨特性降低,而巯基乙醇添加量达50 μmol/L或以上时则可促进hAMSCs的钙基质沉积。为进一步提高微组织的性能,以浓度为50 μg/ml抗坏血酸盐和50 μmol/L巯基乙醇作为添加剂,考察在微组织制备过程中上述添加剂对hAMSCs细胞增殖、基质分泌和成骨分化的影响,以及上述不同条件制备的微组织装配形成的工程化骨组织结构和性能差异。结果显示,添加抗坏血酸盐对细胞增殖及胞外基质表达无明显促进作用,但添加巯基乙醇不仅能促进细胞增殖,而且有利于微载体聚集成粒径800～900μm的聚团,这些聚团经过20 d的成骨诱导后能够成为具有显著成骨特征的骨微组织,将其装配塑形并灌注培养7d后,形成了直径20 mm、高10mm的大尺寸工程化骨组织,其中的细胞密度、细胞活性及胞外基质分泌沉积等显著高于对照组和抗坏血酸盐组,说明添加巯基乙醇不仅能促进细胞增殖,而且还能增强工程化组织的成骨表型。最后,本文还考察了在微组织装配形成大组织的过程中体外灌注培养时间对工程化组织性能的影响,并采用皮下移植实验分析其体内成骨能力。研究发现,当灌注培养时间延长至2周时,工程化组织中的细胞活性、组织结构及成骨分化等性能均有显著提升。皮下移植实验结果显示,灌注2周形成的组织在小鼠体内能够更好地维持移植物的形态、组织活性和胞外基质沉积。综上所述,本文利用人羊膜来源间充质干细胞和大孔CuitiSpher S微载体,在转瓶微载体悬浮培养体系中成功建立了集干细胞生长-分化为一体的微组织制备方法,并通过在微组织制备过程中添加巯基乙醇这一小分子化合物,显著提高了微组织细胞密度,促进了基质分泌和组织形成。采用自制的灌注塑形培养装置经体外装配后,构建形成了突破传质限制尺寸、高细胞活性、胞外基质分布均一的厘米级工程化骨组织,该组织在体内可维持生理生化特性。以上结果说明,组织微构重塑技术是一种行之有效、富有潜力的体外组织构建方法,它为未来大型工程化组织的体外构建提供了新的途径和方法,也为加快组织工程产品的产业化和临床应用创造了条件。
[Abstract]:In vitro construction of engineered bone tissue ( hAMSCs ) is a new technique in vitro construction and clinical application of human amniotic mesenchymal stem cells ( hAMSCs ) . The results showed that the growth of hAMSCs was not only promoted by adding ascorbic acid salt to 50 渭mol / ml ascorbic acid salt and 50 渭mol / L mercapto ethanol . It also creates conditions for speeding up the industrialization and clinical application of tissue engineering products .

【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318

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