HIF-1α介导BMSCs复合PLGA修复大鼠颅骨标准骨缺损的实验研究

发布时间：2018-03-07 17:54

  本文选题：HIF-1α　切入点：BMSCs　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的通过基因转染技术,利用HIF-1α基因修饰SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),体外实验检测目的基因调控BMSCs成骨和成血管向分化的作用,并构建HIF-1α介导BMSCs复合PLGA支架材料血管化组织工程骨,通过观察其在大鼠颅骨标准骨缺损中的修复效果,探索目的基因双重调控作用,为将来临床上修复骨缺损提供部分实验依据,奠定一定的理论基础。方法体外分离和培养SD大鼠BMSCs,构建慢病毒载体Lenti-HIF-1α,并用该载体转染BMSCs,在转染后的1~7d镜下观察病毒转染效率和细胞生长状态,确定该载体最佳转染复数MOI值;运用MTT比色分析法检测HIF-1α对BMSCs增殖的影响。在Lenti-HIF-1α转染BMSCs的第1天、第4天、第7天、第14天和第21天提取m RNA,利用RT-PCR检测关键性成血管因子VEGF和成骨因子OCN的表达。将转染目的基因HIF-1α的BMSCs与支架材料PLGA共培养构建复合体,扫描电镜观察BMSCs和转染目的基因HIF-1α后的BMSCs在PLGA支架材料上的附着生长情况及材料的形态。并用上述构建的细胞与支架材料共培养复合体修复SD大鼠颅骨双侧直径5mm的标准骨缺损(n=18),随机分为三组:实验组植入HIF-1α-BMSCs/PLGA复合体(n=6),对照组植入BMSCs/PLGA复合体(n=6),材料组仅植入PLGA支架材料(n=6)。术后8周处死大鼠并取材,分别行大体观察、X线片检查和HE染色观察大鼠颅骨缺损区骨修复效果。收集的实验数据均以均数±标准差表示,使用SPSS 16.0统计软件进行方差分析,当P0.05时,为差异具有统计学意义。结果普通显微镜下可见BMSCs呈贴壁生长,细胞形态呈长梭形或多角形,旋涡状生长。当感染复数(MOI)=12时,Lenti-HIF-1α转染BMSCs的效率最高,并且在病毒转染后的第7天,镜下观察病毒转染效率达80%以上,MTT比色分析法检测结果显示HIF-1α对细胞的增殖无显著影响(P0.05);RT-PCR结果显示,与单纯BMSCs相比,Lenti-HIF-1α转染BMSCs后的第4天、第7天、第14天和第21天,可明显促进成血管因子VEGF的表达,目的基因转染后的第7天、第14天和第21天,能明显促进成骨因子OCN的表达(P0.05)。扫描电镜结果显示单纯BMSCs及转染目的基因HIF-1α后的BMSCs均可于支架材料PLGA的表面附着生长,且PLGA支架材料呈三维立体多孔状结构。SD大鼠颅骨标准骨缺损的修复效果通过大体观察、X线片检查和HE染色均显示实验组缺损区新骨形成量明显多于对照组及材料组,差异有统计学意义(P0.05)。结论以慢病毒为载体的HIF-1α能够成功转染至BMSCs中,并持续上调BMSCs中成骨、成血管因子的表达。体外实验证明HIF-1α能够显著促进BMSCs向成骨和成血管方向分化。体内研究表明HIF-1α能够介导BMSCs促进骨组织形成,PLGA是理想的支架材料之一,用其构建的血管化工程骨能够有效修复骨缺损。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of HIF-1 伪 gene on the regulation of BMSCs osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) of SD rats by gene transfection in vitro. The vascularized tissue engineering bone of HIF-1 伪 -mediated BMSCs composite PLGA scaffold was constructed. By observing the repair effect of HIF-1 伪 -mediated BMSCs scaffold in the standard bone defect of rat skull, the double regulation of target gene was explored. To provide some experimental evidence for clinical repair of bone defect in the future. Methods Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro, and lentivirus vector Lenti-HIF-1 伪 was constructed. The vector was transfected with BMSCs. The transfection efficiency and cell growth state of the vector were observed under the microscope for 1 ~ 7 days after transfection, and the optimal complex MOI value of the vector was determined. MTT colorimetric assay was used to detect the effect of HIF-1 伪 on the proliferation of BMSCs. On day 1, day 4 and day 7 of Lenti-HIF-1 伪 transfection of BMSCs, HIF-1 伪 was used to detect the proliferation of BMSCs. On the 14th and 21st days, RT-PCR was used to detect the expression of VEGF and OCN. The BMSCs transfected with the target gene HIF-1 伪 was co-cultured with the scaffold PLGA to construct the complex. The growth and morphology of BMSCs and BMSCs after transfection of target gene HIF-1 伪 on PLGA scaffold were observed by scanning electron microscope. The bilateral diameter of skull of SD rats was repaired with the cell and scaffold co-culture complex. A 5mm standard bone defect was randomly divided into three groups: the experimental group was implanted with HIF-1 伪 -BMSCs / PLGA complex, the control group was implanted with the BMSCs/PLGA complex, and the control group was only implanted with the PLGA scaffold material. The rats were sacrificed 8 weeks after operation. The effect of bone repair in the skull defect of rats was observed by gross X-ray examination and HE staining. The collected experimental data were expressed as mean 卤standard deviation, and the variance analysis was carried out by SPSS 16.0 statistical software. Results under ordinary microscope, BMSCs was observed to be adherent growth, cell morphology was fusiform or polygonal, swirling growth. When infected with plural moi = 12:00 Lenti-HIF-1 伪, the efficiency of transfection of BMSCs was the highest, and on the 7th day after virus transfection, the effect of Lenti-HIF-1 伪 transfection was the highest. The results of MTT colorimetric assay showed that HIF-1 伪 had no significant effect on cell proliferation. The results of RT-PCR showed that HIF-1 伪 had no significant effect on cell proliferation. Compared with BMSCs alone, BMSCs was transfected on the 4th, 7th, 14th and 21st day after transfection. The expression of angiogenic factor VEGF was significantly increased on day 7, day 14 and day 21 after transfection. The results of scanning electron microscope showed that both BMSCs and BMSCs after transfection of target gene HIF-1 伪 could grow on the surface of the scaffold PLGA. The repair effect of standard bone defect of PLGA scaffold was three-dimensional and porous. The results of X-ray examination and HE staining showed that the amount of new bone formation in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the material group. Conclusion the lentivirus vector HIF-1 伪 can be successfully transfected into BMSCs and continuously up-regulate osteogenesis in BMSCs. In vitro, HIF-1 伪 can significantly promote the differentiation of BMSCs into osteogenesis and vascularization. In vivo studies show that HIF-1 伪 can mediate BMSCs to promote the formation of bone tissue. HIF-1 伪 is one of the ideal scaffolds. The vascularized bone can be used to repair the bone defect effectively.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

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本文编号：1580335