载缩宫素二氧化硅介孔材料的制备、表征及生物安全性评价

发布时间：2018-03-13 06:48

本文选题：脂肪源间充质干细胞　切入点：缩宫素　出处：《吉林大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：SiO2有序介孔材料作为药物载体使用已经有十余年时间。这种生物陶瓷类材料比之传统的药物载体系统更加受到青睐主要是源于两大特性：高度可控的物理化学性能和在材料刺激-应答方面的潜能。有序介孔材料本身具有通过共价键与特定生物活性分子相嫁接，从而刺激靶细胞形成新生组织的优良特性，就更加复合组织工程学材料的需求，尤其是骨组织工程材料。本实验用模板法将材料制备成具有纳米级介孔结构的药物载体，并对材料进行表征和体内、外生物活性检测。 OT是自垂体后叶分离出的一种9肽激素，在体外可通过苄氧羰醛亮氨酸对硝基苯酯经化学合成法制得。OT在体内的功能性受体属于G蛋白偶联受体家族中的速激肽受体。随着缩宫素在骨代谢领域相关作用的逐步阐明，已经有学者预言未来它将成为能够治疗骨质疏松的药物之一。本实验选择OT作为研究对象，一方面检测OT在刺激脂肪源干细胞增殖和成骨向分化方面的作用；同时将其作为药物模型进行了OT—SBA-15载药体系的装载、释放动力学检测以及载药体系的体内、外安全性实验。为今后进一步开展动物模型研究奠定基础。 1人脂肪干细胞的分离、培养和鉴定目的：分离、培养和鉴定人脂肪干细胞方法：通过合法途径获取健康人废弃脂肪组织，处理后接种于10%胎牛血清、100U/ml双抗的DMEM培养基内，常规培养，定时换液，待细胞融合达80%，胰酶消化传代。取传三代生长稳定细胞镜下观察形态。取传3~4代生长稳定的细胞，应用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD44、CD29、CD34和CD45；用成骨培养基诱导并茜素红染色评价其成骨向分化潜能；用成脂肪培养基诱导并红油O染色评价其成脂向分化潜能。结果：传三代后细胞生长稳定，呈长梭型，形态与成纤维细胞类似。核仁清晰、边界明显、细胞生长密集是呈鱼群状或旋涡状生长。细胞表面标记物鉴定间充质细胞表面特征性标记物CD44、CD29呈高表达；造血干细胞及内皮细胞表面特征性标记物CD34和白细胞表面特征性标记物CD45均为阴性，说明细胞为高度均一性的脂肪源间充质干细胞。经成骨诱导剂培养后茜素红染色可见明显的钙化结节，说明细胞具有成骨向分化潜能。经成脂诱导剂培养后红油O染色可见明显的脂滴，说明细胞具有成脂向分化潜能。 2缩宫素对人脂肪源干细胞成骨活性的影响目的：评价缩宫素对人脂肪源干细胞增殖活性的影响；评价缩宫素对人脂肪源干细胞碱性磷酸酶活性的影响；检测其作用于人脂肪源干细胞的最低有效浓度。方法： WST-1：将缩宫素按照不同浓度范围高浓度组（100nmol.L-1）、中浓度组（50nmol.L-1）、低浓度组（10nmol.L-1），另设空白对照组。在1d、7d、14d、为观察点，用WST-1检测细胞增殖情况。ELISA：同样将缩宫素按照高浓度（100nmol.L-1）、中浓度（50nmol.L-1）、低浓度（10nmol.L-1）进行分组，另设空白对照。在7d和14d用成品试剂盒进行碱性磷酸酶活性检测。结果： WST-1检测结果显示低浓度缩宫素在第1天、第7天、第14天均略高于对照组，但没有显著性差异。中浓度和高浓度组在加药后第一天即表现出对脂肪干细胞增殖的促进作用，且这种作用随时间逐渐明显，至第14天达到高峰。另缩宫素对脂肪干细胞增殖的促进作用在一定范围呈剂量依赖性。ELISA检测显示在第7天，低浓度组的碱性磷酸酶活性略高于对照组，但没有显著性差异，中浓度和高浓度组碱性磷酸酶活性依次升高，同对照组相比有显著性差异。在第14天，中浓度组和高浓度组碱性磷酸酶活性达到最高，且与对照组相比有显著性差异。各组碱性磷酸酶活性随时间逐渐升高，且对缩宫素浓度呈剂量依赖性。 3二氧化硅介孔材料SBA-15的初步合成及表征目的：合成SBA-15介孔材料，并对材料的结构和性能进行表征方法：将P123三嵌段表面活性剂溶于适量去离子水，在35~40摄氏度条件下向体系中加入盐酸(HCl)和正硅酸乙脂(TEOS)，使用磁力搅拌子持续剧烈搅拌24小时以上，将反应体系移入乙烯瓶进行晶化过程，72小时后对材料进行过滤、洗涤、干燥。550℃焙烧5小时，并用有机溶剂反复冲洗以去除有机模板剂，最后过滤、洗涤并干燥、研磨材料，得到的白色粉末即为SBA-15粉末材料。利用元素分析、X线衍射分析、SEM成发射扫描电镜、TEM扫描电镜、氮吸附试验等手段对材料进行表征。结果：元素分析显示合成材料高纯度Si-O无机物，扫描电镜下呈直径20~50微米颗粒，颗粒表面为粗糙的纳米结构，透射电镜下可见颗粒内部有大量纳米级孔道结构，XRD检测结果材料结构均一，氮吸附检测为IV型吸附曲线，是典型的（直型孔道结构的）介孔材料吸附曲线,具有较窄的孔径分布。最终合成为高纯度SiO2介孔材料SBA-15。 4OT在SBA-15材料中的装载和释放目的：以OT作为药物模型，研究OT/SBA-15体系的组装及释放动力学特点。方法：用OT进行药物组装及释放的实验，检测体系最大载药量、所需的最佳浓度和时间，以及药物—载体系统的释放动力学特点。结果：OT在0.06mol/L浓度下，6小时即可达到最大载药量，约为35%质量分数。OT/SBA-15材料体系在释放过程的前4小时，有明显突释现象，即有将近40%的药物释放。之后的药物释放逐渐平缓。至32小时，有将近90%的药物全部释放，释放过程基本完成。 5SBA-15生物活性的体内、外研究目的：检测SBA-15材料的细胞毒性及生物相容性方法：制备不同浓度SBA-15浸提液，MTT检测其细胞毒性；进行SBA-15体外溶血实验；用MG-63人成骨细胞系进行材料直接接触实验。分别设置SBA-15组、OT/SBA-15组、空白对照组，检测其对人脂肪源间充质干细胞成骨向分化的影响。制造兔颅骨缺损，采用局部注射给药的形式，通过钙盐沉积量检测和组织学分析，验证SBA-15在体内的安全性以及OT/SBA-15载药体系对骨缺损修复的促进作用。结果：在细胞毒性检测中，2倍至20倍浓度SBA-15材料浸提液均表现无细胞毒性。体外溶血实验中溶血率为3.1%，低于5%，，不会引起急性溶血反应。直接接触实验显示细胞在材料表面生长状况良好。SBA-15材料对人脂肪源间充质干细胞的成骨向分化没有影响，OT/SBA-15载药系统明显促进人脂肪源间充质干细胞的成骨向分化、增强碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原活性。SBA-15在体内生物安全性良好，没有明显的炎症反应，不会对骨缺损的修复产生影响；负载缩宫素后的SBA-15能够再体内缓慢释放药物，对骨缺损的修复有明显的促进作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.1

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