组织工程化模型探讨异常力学刺激诱导心脏瓣膜钙化机制研究

发布时间：2018-03-21 01:30

本文选题：瓣膜钙化　切入点：异常力学　出处：《华中科技大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分组织工程化二叶瓣心脏瓣膜模型构建及诱导钙化效果评估目的：构建组织工程化心脏瓣膜，缝制三叶和二叶瓣瓣膜模型，组装生物反应器系统对模型进行流体力学刺激，获得异常力学刺激诱导瓣膜钙化模型，评估建模效果并确定最佳建模条件。方法：应用四分枝枝化状聚乙二醇（PEG）改性去细胞猪主动脉瓣，并共价键合RGD肽，获得组织工程化心脏瓣膜。从正常瓣膜标本分离培养，得到原代人瓣膜间质细胞（huVICs）并鉴定。组织工程化瓣叶接种huVICs后，缝于定制钛镍合金瓣架上，获得三叶及二叶瓣瓣膜模型。应用BWET人工心脏瓣膜脉动流检测仪测定所缝制三叶瓣及二叶瓣模型的流体力学性能。应用WT600-1F滚压式蠕动泵和自制反应腔组装生物反应器系统，实验分组为：三叶瓣零流量组（A），三叶瓣生理流量组（B），二叶瓣零流量组（C）和二叶瓣生理流量组（D）（n=4），分别干预14d后取出瓣叶，行扫描电镜检测及钙化指标检测（ALP含量测定、Runx2/Cbfα-1免疫组化染色、von Kossa染色）结果：所缝制的组织工程化三叶瓣模型开放完全，闭合紧密；二叶瓣模型闭合基本正常，开放则明显受限。离体流体力学性能检测显示，在相同心率及心输出量条件下，两种瓣膜模型的平均动脉压和返流百分比均无明显差异（P0.10），而二叶瓣的开口面积明显小于三叶瓣组（P0.001），其跨瓣压差也显著升高（P0.001）。应用生物反应器对接种huVICs的两种瓣膜模型进行流体力学刺激，14d后扫描电镜检测发现：零流量状态下，A、C组huVICs生长状态良好，单层覆盖组织工程化瓣叶材料表面，胞间连接紧密，然而排列无极性。在生理流量刺激下，B组瓣叶表面huVICs仍为单层覆盖生长，呈现明显的平行于流体方向的极性排列，细胞形态基本正常。然而D组二叶瓣瓣叶表面的huVICs形态发生明显变化，胞质发出伪足，丧失排列极性，呈无序状生长。A、B、C组瓣叶中ALP含量较低，组间差异无统计学意义（P0.05），而D组ALP含量显著升高（P0.01）。Runx2免疫组织化学染色结果显示，四组瓣叶表面均有单层细胞附着生长，A、B、C组中表层细胞中染色呈阴性，D组中则见细胞胞质内Runx2阳性染色。von Kossa染色证实A、B、C组瓣叶样本中无阳性染色，D组瓣叶细胞接种面散在钙盐沉积点，但分布较局限。结论：联合应用组织工程化二叶瓣瓣膜和生物反应器系统可以成功构建异常力学刺激诱导瓣膜钙化模型。第二部分TGF-β1/BMP-2信号通路在异常力学刺激诱导组织工程化瓣膜钙化中机制研究目的：应用组织工程化二叶瓣瓣膜模型，探索TGF-β1/BMP-2通路在异常力学刺激诱导瓣膜钙化中的激活程度。方法：以第一部分所构建的组织工程化二叶瓣模型为研究对象，按照生物反应器填充工作液和有无流体力学作用，分为三组：A组：完全培养基，零流量；B组：完全培养基，生理流量；C组：完全培养基（含10ng/ml人重组TGF-β1），生理流量；每组三个模型（n=3）。于干预第3d，7d，14d取出各组瓣叶行钙化程度评估（Runx2蛋白western blot检测及ALP含量检测），采用RT-PCR及western blot方法检测瓣叶组织中TGF-β1及BMP-2的mRNA及蛋白表达水平。结果：ALP含量检测和Runx2蛋白表达水平检测显示：异常力学刺激下B组钙化指标较A组明显升高（P0.05），C组在异常力学作用基础之上加入外源性TGF-β1，瓣膜钙化水平较B组进一步加重（P0.05）。RT-PCR和western blot检测显示：A组瓣叶TGF-β1、BMP-2的mRNA和蛋白含量都保持在较低水平；B组瓣叶的两种信号分子的转录和翻译水平明显上调（P0.05）。C组在钙化程度加重的同时，BMP-2的转录和翻译水平也明显升高（P0.05）。结论：异常力学刺激下，组织工程化瓣叶在发生钙化改变的同时，其huVICs中TGF-β1及BMP-2转录与翻译水平均发生上调。添加外源性TGF-β1可加重瓣叶钙化程度，并上调瓣膜中BMP-2表达。从而证实TGF-β1和BMP-2可能处于同一条信号通路的上下游，且该通路参与介导异常力学刺激诱导瓣膜细胞发生钙化改变。第三部分BMP-2基因沉默对异常力学刺激诱导组织工程化瓣膜钙化作用研究目的：通过RNA干扰技术抑制huVICs中BMP-2表达，探讨BMP-2下游信号分子在异常力学刺激诱导瓣膜钙化过程中的可能作用。方法：构建BMP-2shRNA质粒，LipofectamineTM2000介导转染huVICs，检测转染效果。应用BMP-2基因沉默的huVICs、空白质粒转染huVICs及正常huVICs分别制备组织工程化二叶瓣模型。根据种子细胞不同以及有无生物反应器作用，将模型分为六组分别干预：A组：正常细胞，零流量组；B组：正常细胞，，生理流量组；C组：BMP-2基因沉默细胞，零流量组；D组：BMP-2基因沉默细胞，生理流量组；E组：空白质粒转染细胞，零流量组；F组：空白质粒转染细胞，生理流量组；每组三个模型（n=3）。于干预第3d，7d，14d取出各组瓣叶行钙化程度评估（Runx2蛋白westernblot检测及ALP含量检测），并检测BMP-2相关通路蛋白（BMP-2、Smad1、Msx2）的mRNA及蛋白表达水平。结果： BMP-2shRNA质粒可经脂质体介导转染huVICs并获得较为满意的转染效果。经ALP含量检测和Runx2蛋白表达水平检测证实，BMP-2基因沉默处理后瓣叶（D组）在异常力学作用下的钙化程度较无力学刺激组有所升高，但其升高程度显著低于B、F组（P0.01）。RT-PCR及western blot检测发现，力学作用下瓣叶B、F组BMP-2、Smad1、Msx2的mRNA和蛋白含量均有显著上调（较A、C、E组，P0.001），而接种BMP-2沉默huVICs的D组瓣叶在异常力学作用下，BMP-2、Smad1转录、翻译水平无显著升高，其含量明显低于同样干预条件下B、F组水平（相比A、C、E组，P0.05，相比于B、F组，P0.01）。Msx2的mRNA及蛋白含量则仍有显著升高（相比A、C、E组，P0.001）。结论：RNA干扰抑制BMP-2表达，可有效下调Smad1的mRNA及蛋白表达水平，阻断异常力学刺激的诱导钙化效果，而异常力学刺激下Msx2的转录翻译水平仍升高，提示BMP-2/Smad1经典通路在异常力学刺激诱导瓣膜钙化中起重要信号转导作用。而BMP-2/Msx2非经典通路则不参与介导异常力学刺激的钙化诱导效应。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】