壳聚糖微球支架用于骨组织工程的基础研究

发布时间：2018-03-31 13:41

本文选题：骨组织工程　切入点：壳聚糖微球　出处：《武汉大学》2014年博士论文

【摘要】：与传统支架比较,微球作为骨组织工程支架具有显著优势：(1)微球可注射,能通过微创手术填充不规则的或复杂的骨缺损；(2)微球作为细胞载体,细胞/微球复合体可以直接植入体内,避免胰酶消化、离心等,操作方便,还能提高细胞活力；(3)微球作为药物载体,能缓释生物活性因子,进一步促进细胞的增殖、分化和体内骨形成。壳聚糖是一种天然聚合物,与细胞外基质的多糖成分类似,具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性,被广泛应用于载药、组织工程等诸多生物医学领域。作为一种性能优越的支架材料,壳聚糖微球在骨组织工程领域也得到了广泛的研究,然而,目前还存在许多问题有待明了。例如(1)在制备壳聚糖微球的过程中,干燥是必不可少的步骤。常用的方法有两类：自然干燥法(将湿润微球置于室温、37℃或60℃的环境中,在空气中干燥)和冷冻干燥法(先将湿润微球置于-20℃、-80℃或液氮中冷冻,再转移至冷冻干燥机中干燥)。两种干燥方法涉及不同的原理和过程,这是否会影响到壳聚糖微球的理化性能,进而影响到生物活性分子的装载、释放和生物活性?(2)壳聚糖微球的制备方法多样,包括凝集沉淀法、乳化交联法、离子交联法、喷雾干燥法等,不同的制备方法是否会影响到壳聚糖微球的理化性能和生物性能?从而影响到体内的成骨效果?(3)作为骨组织工程支架,细胞须与支架复合,然后植入骨缺损区。细胞在复合前或复合后的状况都可能影响到体内的成骨效应。细胞与支架究竟培养多长时间才最有利于体内的骨生成? 上述问题,当然并不仅限于以上问题,是壳聚糖微球支架应用于骨组织工程中的常见问题,然而,相关的研究较少。基于此,在本论文中,我们(1)选择自然干燥法(37℃空气中)和冷冻干燥法(-80℃C冷冻),以地塞米松为模型药物,研究不同的干燥方法对壳聚糖微球的理化性能和载药性能的影响；(2)选择凝集沉淀法和乳化交联法分别制备壳聚糖微球,并在微球表面仿生沉积磷灰石,研究这两种制备方法对壳聚糖微球理化性能和磷灰石沉积的影响,并通过体内、外实验来评估壳聚糖微球的生物学活性；(3)选择不同的体外成骨诱导培养时间,研究大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)/壳聚糖微球复合体在修复骨缺损前是否需要成骨诱导,以及不同的成骨诱导时间对微球支架修复骨缺损的影响。第一部分两种干燥方法对壳聚糖微球支架理化性能和载药性能的影响目的：研究自然干燥法和冷冻干燥法对壳聚糖微球支架理化性能和载药性能的影响。材料和方法：首先用凝集沉淀法制备湿润的壳聚糖微球,然后选用自然干燥法和冷冻干燥法进行干燥,检测干燥微球的理化性能。以地塞米松为模型药物,检测药物在壳聚糖微球中的包封率和释放曲线,并通过检测从微球中释放的地塞米松对于大鼠BMSCs增殖、分化的影响,来评估地塞米松的生物活性。结果：与冷冻干燥微球比较,自然干燥微球的溶胀率较低,降解速度较慢,洛氏硬度较大,装载地塞米松的包封率较低,释放速率较慢。细胞测试表明,两种载药微球均能显著促进BMSCs分化,而且促进的程度相似。但与空白的未载药微球比较,载药的冷冻干燥微球抑制了BMSCs的增殖,而载药的自然干燥微球对细胞的增殖无不良影响。结论：干燥方法会影响支架的理化性能,进一步影响地塞米松的装载和释放；自然干燥方法更适合于制备载地塞米松的壳聚糖微球。第二部分两种制备方法对壳聚糖微球支架修复骨缺损的影响目的：研究凝集沉淀法和乳化交联法对壳聚糖微球理化性能和磷灰石沉积的影响,并以大鼠BMSCs为种子细胞,评估磷灰石涂层的壳聚糖微球支架作为细胞载体用于骨组织工程的可行性。材料和方法：分别采用凝集沉淀法和乳化交联法制备壳聚糖微球,然后在微球表面仿生沉积磷灰石涂层。通过SEM观察微球的表面形态,采用XRD、FTIR分析涂层的成分,检测微球的交联度、溶胀率、降解率。分离、培养大鼠BMSCs,将BMSCs与微球进行复合,检测细胞在微球上的贴附、增殖和分化能力。最后将部分BMSCs/微球复合体植入大鼠皮下,分别于术后3、6、12周取材,通过HE染色来观察微球促进异位成骨的能力。另一部分BMSCs/微球复合体植入大鼠颅骨缺损,术后8周取材,通过Micro-CT分析和HE染色来观察微球促进正位成骨的能力。结果：与凝集沉淀微球相比,乳化交联微球具有较低的交联度、较高的溶胀率和降解率、较多的磷灰石涂层。BMSCs在磷灰石涂层的乳化交联微球上表现出最高的增殖、分化能力。皮下植入实验显示,在所有观察时间点,均没有明显的骨生成。颅骨缺损植入实验显示,磷灰石涂层的乳化交联微球修复骨缺损的能力最佳,成熟的新生骨基本修复了骨缺损区；磷灰石涂层的凝集沉淀微球修复骨缺损的能力次之,新生骨修复了大部分骨缺损区；无涂层的凝集沉淀微球修复骨缺损的能力再次之,新生骨修复了部分骨缺损区；而无涂层的乳化交联微球修复骨缺损的能力最低,缺损区由纤维组织长入。结论：制备方法会影响壳聚糖微球的理化性能和磷灰石的沉积,进而影响BMSCs的生物学行为以及细胞／微球复合体促进体内成骨的能力；磷灰石涂层的壳聚糖微球可以考虑作为细胞载体用于骨组织工程。第三部分不同体外成骨诱导培养时间对细胞/壳聚糖微球支架修复骨缺损的影响目的：研究BMSCs/壳聚糖微球复合体在修复骨缺损前是否需要成骨诱导,以及不同的成骨诱导时间对体内成骨的影响。材料和方法：用凝集沉淀法制备湿润的壳聚糖微球,自然干燥后,消毒备用。按实验设计,在微球表面接种大鼠BMSCs,体外成骨诱导0、7、14、21天后,用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖,用PNPP法检测ALP活性,用RT-PCR检测成骨特异性基因包括ALP, COLI OCN的表达变化。最后,将处于不同分化阶段的细胞/壳聚糖微球复合体植入大鼠颅骨缺损区,术后8周取材,进行Micro-CT分析和组织学检测。结果：细胞增殖从第0天到第7天显著增加,从第7天到第21天增殖不明显。第0天时,ALP活性较低,为基础值。诱导7天后,ALP活性显著高于0天组。诱导14天后,ALP活性达到高峰,随后下降。RT-PCR检测结果表明ALP基因表达变化趋势与ALP活性结果一致。COL I基因的表达从第0天到第14天缓慢增加,第21天时,表达水平显著升高(P0.05)。OCN基因的表达在第0天、第7天和第14天表达量很低,但在第21天时,表达量显著升高(P0.05)。体内实验表明诱导0天组,新生骨量较少,微球之间和微球表面主要由纤维组织长入；诱导7天组,有明显的新生骨,但缺损区中央缺乏骨形成；诱导14天组,新生骨量最多,几乎将缺损断端连成整体；诱导21天组,新生骨量与7天组类似,显著低于14天组(P0.05)。结论：BMSCs/壳聚糖微球用于修复大鼠颅骨缺损时,需要进行成骨诱导分化,体外成骨诱导14天时,最有利于骨再生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08

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