以COLⅡ为主要组分的软骨基质仿生水凝胶研制

发布时间：2018-04-17 16:08

本文选题：组织工程 + 水凝胶　；参考：《第三军医大学》2012年硕士论文

【摘要】：关节创伤所致的疼痛、畸形、活动度下降已经成为目前肢体功能不全甚至残疾的主要原因之一[1]。在关节创伤疾病中，软骨的损伤尤其重要[2]。由于关节软骨本身的营养来自于关节液的渗透交换作用，并无血管和神经，所以一旦发生关节疼痛，软骨病变已进入晚期，且目前临床治疗方法疗效局限[3-6]。近年，运用组织工程的思路进行软骨病损的临床治疗，已有一些安全性较好、疗效肯定的方法，例如自体软骨细胞移植（ACI）、基质诱导自体软骨细胞移植（MACI）等。这些组织工程技术的出现揭示了运用组织工程的思路进行软骨修复是未来软骨病损疾病治疗的趋势。但是，ACI以及MACI具有自体软骨细胞来源有限、需要二次手术及自体软骨供区并发症等局限，因此其适用范围较局限。软骨基质仿生水凝胶具有生物相容性好、促进种子细胞成软骨分化及表达Ⅱ型胶原蛋白、维持软骨细胞形态的作用[7,8]。因此，本研究在微创、仿生理念的指导下，从猪膝关节软骨中提取了Ⅱ型胶原蛋白并对其纯度及成分进行了初步鉴定；运用碱中和法制备了猪透明软骨Ⅱ型胶原（CollagenⅡ，COLⅡ）水凝胶，并对其水解率、溶胀度等相关理化特性进行了初步检测；通过与骨髓来源干细胞（主要包括间充质干细胞）进行4周共培养对其细胞相容性的观察以及单纯凝胶小鼠背部皮下埋植实验1周、3周、9周对其组织相容性的观察，本研究对其生物相容性进行了初步评价；运用基质仿生理念[9-11]，在前期试验基础上，通过复合正常软骨细胞外基质-硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）、透明质酸（hyaluronan，HA）与COLⅡ，课题组制备出了仿生的COLⅡ-CS-HA复合水凝胶；并对COLⅡ及COLⅡ-CS-HA复合骨髓来源干细胞修复猪股骨滑车全厚软骨缺损的效果进行了短期（4周）的现象观察。通过3.0T高场强磁共振检测、大体观察、体视显微镜观察、组织学染色等方法，课题组认为COLⅡ以及COLⅡ-CS-HA复合水凝胶均可以对猪膝关节全厚软骨缺损进行修复，且后者修复物中Ⅱ型胶原含量较前者更好。一、实验方法 1．猪膝关节软骨Ⅱ型胶原蛋白（COLⅡ）的提取及鉴定本研究从猪膝关节透明软骨中提取了Ⅱ型胶原蛋白，通过氨基酸分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、番红O染色、摇菌实验等方法，对自提胶原蛋白的性质、纯度、浓度进行了初步评价。 2．COLⅡ水凝胶制备及相关理化性能、生物相容性实验： ①运用碱中和原理，制备出在4℃为溶胶态，37℃、6-8min相变为凝胶态的COLⅡ凝胶，并且对其微观结构进行观察。 ②体外水解实验对制备的COLⅡ水凝胶的水解度、溶胀度及含水量进行初步评价。 ③COLⅡ水凝胶-骨髓来源干细胞（主要为骨髓间充质干细胞）共培养4周，运用HE染色、固绿-番红O染色、阿尔新蓝染色初步对凝胶的细胞相容性进行初步评价。 ④COLⅡ水凝胶昆明小鼠背部皮下埋植1周、3周、9周后，运用HE染色、Mallory染色，，对凝胶的组织相容性进行初步评价。 3．COLⅡ-CS-HA复合水凝胶的制备运用基质仿生的理念，在前部分实验的基础上，课题组将自提Ⅱ型胶原蛋白（COLⅡ），及购买的医用硫酸软骨素（CS）、透明质酸（HA）复合，构建了Ⅱ型胶原蛋白-硫酸软骨素-透明质酸复合水凝胶，并且对其大体性状及微观结构进行观察。 4．COLⅡ与COLⅡ-CS-HA复合凝胶对保留钙化层的猪膝关节滑车全厚软骨缺损修复效果进行4周短期初步的现象观察。 ①3.0T MRI对复合凝胶的修复效果进行在体无创观察 ②大体及体视显微镜，对缺损的表面及剖面进行大体观察 ③组织学染色对其修复效果进行观察 ④免疫组化染色对缺损修复物性质进行观察二、实验结果 1．猪膝关节软骨Ⅱ型胶原蛋白（COLⅡ）的提取及鉴定。反复实验后，本实验每次取50g猪膝关节透明软骨后可提取出3-4g的Ⅱ型胶原蛋白。经冻干后测定，自制Ⅱ型胶原-HCl溶胶浓度为66mg/ml，浓度高、纯度好，经过SDS-PAGE电泳及氨基酸分析鉴定，实验室自提Ⅱ型胶原蛋白基本符合COLⅡ的蛋白质组学特点。 2．COLⅡ水凝胶的制备与评价： 2.1扫描电子显微镜（SEM）示所制备的COLⅡ凝胶具有均匀的孔分布及良好的孔连通性； 2.2水解实验示，COLⅡ水凝胶20天后水解率为30%左右；通过比较冻干前后质量，测量其溶胀度为2684%，含水量在90%以上； 2.3细胞相容性实验示骨髓来源干细胞在水凝胶中能够正常悬浮生长并且分裂，未发现明显细胞空泡及细胞核的破裂、溶解； 2.4昆明小鼠背部皮下埋植实验示水凝胶材料在1w时还有部分存在于皮下且有炎细胞浸润；3w时材料基本消失，炎细胞较1w时明显减少；9w时材料被完全吸收，未发现明显炎细胞浸润。 3．COLⅡ-CS-HA复合水凝胶的制备。SEM示制备的Ⅱ型胶原蛋白-硫酸软骨素-透明质酸复合水凝胶具有较好的孔分布及孔连通性。 4．4周贵州小香猪动物实验观察结果： 4.13.0T高场强磁共振观察示：软骨层可以在MRI中清晰显影，各组关节腔内未发现明显滑膜增生及关节积液；复合了骨髓来源干细胞的水凝胶（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）组，在缺损处均能观察到较高信号的修复组织生成，软骨下骨及深部骨髓未见明显异常信号；未复合细胞的水凝胶（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）组在缺损处也能观察到较高信号生成，但较复合细胞组信号弱，且在软骨下骨有异常信号。 4.2大体及体视显微镜示无论是否复合细胞，在缺损处均能观察到修复物填充；复合了骨髓来源干细胞的水凝胶（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）组，在缺损处能观察到淡白色均质的修复组织生成，其性状及饱满度均优于未复合细胞的水凝胶（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）组。 4.3组织学及免疫组化染色示：复合了骨髓来源干细胞的水凝胶组（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA）修复效果优于未复合细胞的水凝胶组；在复合了骨髓来源干细胞的水凝胶组（包括COLⅡ及COLⅡ-CS-HA），固绿-番红O染色及阿尔新蓝染色发现在缺损边缘及底部均有阳性染色，且在该组缺损处可以找到分化的软骨细胞，提示局部可能有软骨蛋白多糖生成；天狼星红及Ⅱ型胶原免疫组化染色示仿生构建的种子细胞+COLⅡ-CS-HA复合水凝胶组其修复组织中细胞密度高且Ⅱ型胶原含量高于种子细胞-Ⅱ型胶原蛋白水凝胶组，提示前者修复反应更强烈且修复物性质较种子细胞+COLⅡ水凝胶组更类似于透明软骨。三、全文结论 1．本研究提取的Ⅱ型胶原蛋白纯度高、浓度好，其蛋白质组学性质基本符合Ⅱ型胶原蛋白特点。 2．本研究制备的Ⅱ型胶原蛋白水凝胶具有较好的组织及细胞相容性。 3．本研究构建的Ⅱ型胶原蛋白-硫酸软骨素-透明质酸水凝胶复合骨髓来源干细胞后对猪股骨滑车全厚软骨缺损有短期的修复效果，且修复物近似于透明软骨。但是，本课题未对水凝胶材料的具体理化特性（包括粘弹性、体内酶解性等）及生物安全性（包括急慢性炎症反应、溶血反应及遗传毒性等）进行深入研究，而且缺乏长期的大动物实验修复效果评价。关于这些方面的内容将在以后的工作中进行深入探讨。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.08

【参考文献】