多孔羟基磷灰石支架材料的制备及其材料学特性和生物学特性的实验研究

发布时间：2018-04-23 14:07

  本文选题：骨组织工程 + 成骨　； 参考：《北京协和医学院》2013年博士论文

【摘要】：研究背景及目的： 随着科技的进步和社会的发展,以及环境因素的改变,大面积创伤、严重的感染性疾病(包括结核)以及骨肿瘤的发生率较几十年前有了明显的提高。再加上以上疾病尤其是肿瘤,术中需要大量切除组织,从而造成大面积的组织缺损尤其是骨缺损。在骨科领域里,大面积骨缺损的治疗是治疗上的重点、难点。植骨成为治疗这类疾病的唯一选择。植骨的原料主要包括自体骨、同种异体骨、异种骨以及人工骨。自体骨由于其良好的骨诱导性和骨传导性,多年来一直为植骨材料选择的“金标准”,具有良好的治疗效果,但存在来源有限、修复范围局限的缺点,且由于存在供区创伤还可能导致供区并发症如取骨区疼痛等。同种异体骨及异种骨不存在骨量受限以及取骨区并发症的缺点,因而能够明显增加修复骨缺损的范围,但缺点在于存在移植后排斥反应,远期疗效不及自体骨。人工合成骨是近年来开始出现的一种仿生骨,随着组织工程技术的发展已经成为替代上述几种骨的热门选择,并已开始广泛应用于临床。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)作为其中一种人工骨材料,因为其主要成分与骨骼相似,已开始作为组织工程支架应用于骨科临床,疗效肯定。另一方面,支架材料的孔径大小和孔隙率被认为在影响细胞扩增和活性可能起到重要的作用。因此,我们将此材料行体外立体培养,观察不同孔隙率的材料其对细胞扩增及活性影响有无区别,再将其植入实验动物体内,观察此种材料是否能够促进骨缺损愈合。 方法： 首先用挤出成形加微波烧结的方法制备不同孔径、同孔隙率、孔径之间完全连通的多孔羟基磷灰石支架材料。之后将材料按照不同孔径大小分为2组,每组6个：A组为设计时孔径在150μm左右的支架材料,B组为设计时孔径在300μm左右的支架材料。于相差显微镜下观察材料孔隙情况并根据刻度尺测量材料孔径(每个材料随意选取5个孔测量孔径,取平均值作为单个材料的孔径,不同孔径的每组材料用此法测6个样品,取平均值为该组材料的孔径),并用排水法计算其孔隙率,求平均值作为该组材料的孔隙率。再将烧结后的支架材料与原羟基磷灰石粉末行物相分析,将其XRD图谱与标准数据库比对,观察经制备工艺后的支架材料其物相有无变化。最后将材料行SEM扫描,观察其表面孔隙情况,以获得材料的基本物理信息。 其次,将小鼠原成骨细胞MC3T3-E1(由美国菌种保存中心提供)接种于DMEM高糖培养基,在37℃、5%CO2环境下培养、复苏并传代。之后将MC3T3-E1细胞悬液垂直滴入灭菌后的直径12mam、高度5mm的圆柱型支架材料(按照材料学部分实验中的分法分为A、B两组)孔隙内部行初步种植,之后将其转移到灌注培养反应器上行灌注培养5天(液体流速3.4ml/min,37℃,5%CO2).灌注培养结束后,行MTT法来比较不同孔隙率的材料之间细胞增殖能力是否不同。之后再测量单位时间内的葡萄糖消耗来反应细胞的代谢活性,从而比较不同孔隙率的材料之间细胞代谢活性有无不同。最后将标本固定、脱水、干燥后喷金,并于扫描电镜下观察贴壁细胞的增殖情况以及活性。 选新西兰大白兔30只,按照一定的随机化方法随机分为6组：A组,无孔材料组,6只,在左侧尺骨制造长度为1.Ocm的骨缺损,并植入长5mm、宽5mm、高10mm的立方体材料；B组,150μm孔径组,6只,手术方式同A组；C组,300μm孔径组,6只,手术方式同A组；D组,500μm孔径组,6只,手术方式同A组；E组,单纯骨缺损组,3只,仅制造骨缺损动物模型,不做材料植入；F组,单纯喂养组,3只,不做任何手术处理。于术后4、8周分别处死动物,将术侧尺、桡骨完整取出,行CT扫描+三维重建观察大体骨缺损愈合情况,行Micro-CT评估支架内骨长入情况。 结果： 挤压成形技术配合微波高温烧结法可以根据预先设计模型制备出内部结构复杂的羟基磷灰石支架材料,其孔径分别为(149.0±6.8)μm和(294.3±8.5)μm,孔隙率分别为(36.7±0.1)%和(52.2±0.2)%。烧结前后的材料行物相分析,均提示为单一的羟基磷灰石成分,此法制备多空羟基磷灰石支架不会使材料变性、分解,但衍射峰半高宽变窄。扫描电镜显示两种材料的内部结构均规则,孔隙为方形,相互连通性良好,行表面观察见羟基磷灰石颗粒呈不规则多边形,相互紧密排列,但个别颗粒之间有微孔形成。 采用灌注培养的方法成功在两组支架材料上培养大量成骨细胞,MTT法结果显示A组OD/质量比值1.31±0.26,B组OD/质量比值1.51±0.43,两组均值之间比较p0.05,差异无统计学意义。葡萄糖消耗结果显示A组葡萄糖消耗量(162.38±33.09)μmol/L,B组葡萄糖消耗量(217.97±27.91)mol/L,两组均值之间比较p小于0.05,差异有统计学意义。扫描电镜结果显示两组支架材料内部均有大量的成骨细胞粘附其上,并由孔隙角落逐渐朝孔隙中央生长。单个的成骨细胞粘附向周围伸出伪足,并分泌大量细胞外基质。 动物实验结果,术后4周,大体观察,4组材料-骨界面之间均有明显缝隙,术后8周时除A组之外其余3组缝隙相对模糊。普通CT结果,术后4周时,仅D组材料周围可见少量新生骨痂,术后8周时A组可见髓腔封闭,其余3组可见新生骨痂,以D组最多。Micro-CT结果,术后4周时3组有孔材料内类骨样物质均较少,术后8周时孔隙内类骨样物质明显增多。 结论： 挤出成型技术结合高温烧结的方法是一种成功有效地制备具有复杂三维结构的多空羟基磷灰石支架材料的方法,能够制备不同孔径、不同孔隙率、空隙间连通性良好的支架材料,且经过制备工艺后材料成分不会发生改变。 通过灌注培养的方法能够使成骨细胞粘附与支架材料之上,并快速增殖。其中,孔径越大、孔隙率越大,成骨细胞的代谢活性越强。 多孔羟基磷灰石支架材料有一定的诱导体内成骨的能力,并且诱导能力随着孔径增大、孔隙率增大而逐渐增大。
[Abstract]:Research background and purpose:
With the progress of science and technology and social development, as well as the change of environmental factors, the incidence of large area trauma, serious infectious diseases (including tuberculosis) and bone tumors has been significantly improved over the past few decades. Bone defect. In the Department of orthopedics, the treatment of large area bone defects is the focus of treatment. Bone graft is the only choice for the treatment of these diseases. The material of bone graft mainly includes autogenous bone, allograft, xenogeneic bone, and artificial bone. Autogenous bone has been selected for many years for bone graft materials. The choice of "gold standard" has good therapeutic effect, but there is a shortcoming of limited source and limited scope of repair. Because of the existence of donor site trauma, the donor area may also lead to the pain of the donor area, such as the pain in the bone area. But the disadvantage lies in the existence of rejection after transplantation and the long-term effect is inferior to that of autogenous bone. Artificial bone is a bionic bone that began to appear in recent years. With the development of tissue engineering, it has become a hot alternative to these kinds of bone, and it has been widely used in clinical practice. Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a new type of bone. One kind of artificial bone material, because its main component is similar to the skeleton, has begun to be used as a tissue engineering scaffold in the Department of orthopedics, with a positive effect. On the other hand, the size and porosity of the scaffold may play an important role in affecting cell expansion and activity. Therefore, this material is cultured in vitro, There is no difference in the effect of different porosity materials on the cell expansion and activity, and then it is implanted into the experimental animal to observe whether this material can promote the healing of bone defect.
Method锛，

本文编号：1792285