毛囊干细胞构建组织工程尿道的实验研究

发布时间：2018-04-29 07:55

本文选题：组织工程 + 种子细胞　；参考：《南方医科大学》2013年博士论文

【摘要】：研究背景因创伤、疾病、遗传缺陷以及一些手术操作所导致的尿道缺损是泌尿外科的常见疾病,尿道组织缺损经常导致尿道内瘢痕形成、尿道狭窄、排尿障碍,有时更会合并下尿路反复感染。病人往往非常痛苦,这时只有尿道组织重建才能是解决病人痛苦的唯一出路。对于尿道组织的重建,人们研究了多种方法,包括单纯材料移植,自体组织移植,如自体口腔黏膜移植,以及复合细胞的组织工程尿道组织移植,组织工程尿道在尿道组织缺损治疗这一领域已经显现出明显的优势。组织工程作为近年来快速兴起的一项全新技术,为修复尿道组织缺损提供了崭新的思路与方法。为了能更清楚地了解组织工程技术,先让我们回顾一下组织工程的发展历史；1994年,美国学者Vacanti等首先利用组织工程学技术,成功制备出具有一定形态结构的小牛活性人工骨。随后,国内外学者对组织工程进行了全面的发展,包括种子细胞的获取、支架材料的研制、生长因子的作用、细胞—支架材料立体培养等。组织工程技术的优点包括：所构建供应移植物具细胞生物活性、生物材料来源广泛、可根据所需预制成形、若采用自体细胞则可大副降低免疫原性、同时避免了自体组织缺损的并发症等。在组织工程化尿道的研究方面,科研工作者们对尿道缺损的组织工程修复技术进行了较为深入的研究,取得了初步成果,证实尿道组织工程学技术修复尿道缺损的可行性。组织工程学的迅猛发展预示着现代医学将由器官移植时代转变为器官重建的时代。尽管组织工程尿道的发展前景非常另人鼓舞,但组织工程尿道的研究中仍然遇到很多问题,理想的种子细胞问题作为组织工程关键性问题之一,制约着尿道组织工程的发展；现阶段在尿道组织工程研究中,表皮细胞、口腔黏膜上皮细胞都曾先后被作为尿道组织工程上皮的种子细胞,但这些种子细胞与理想的尿道组织工程种子细胞仍相距甚远；无论表皮细胞还是口腔黏膜上皮细胞,都要造成病人自身组织的缺损,同时,表皮细胞与口腔黏膜上皮细胞都属于成体细胞,体外被培养扩增等能力都十分有限。而近些年来作为研究热门的胚胎干细胞或iPS细胞,虽然具有极强的体外扩增与分化能力,但都因为其可能出现的致瘤性而不适合组织构建。本研究试图探索毛囊干细胞作为种子细胞的可行性,首先因为在基础与临床研究等多个方面,有多位学者报道毛囊干细胞可以特定地向表皮细胞分化总而替代损伤的表皮；其次,毛囊干细胞作为成体干细胞保留了干细胞应有的极强的体外扩增能力,同时又避免了应用胚胎干细胞可能出现的致瘤性。更重要的是,毛囊干细胞在获取过程中能最大限度的避免对供体的组织伤害。本研究的核心内容之一就是分选富集毛囊干细胞,研究毛囊干细胞的分选富集方法以及毛囊细胞的扩增规律,来为组织工程尿道的构建提供指导,就成了本研究的必须首要解决的问题,因此,毛囊干细胞的分选富集就成为本研究各个实验组成部分的基础,也构成了本论文的第一部分的研究内容。同时,毛囊细胞体外扩增规律的研究一直就与干细胞的研究密不可分。我们拟探索毛囊干细胞的分选富集方法,记录毛囊干细胞的体外扩增的规律。我们选择兔胡须来源的毛囊干细胞进行体外扩增规律的研究,通过生长动力学方法及细胞培养计数来研究其扩增的潜力；以克隆形成率、Keratin19、Keratin15,CD200的表达情况来验证评价分选后所得到的毛囊干细胞含量与纯度,评估分选方法；分析毛囊干细胞在体外扩增过程中的含量变化；初步探讨毛囊干细胞的体外扩增机制。根据已有的研究报道,复合上皮的的组织工程尿道支架优于单纯材料支架,上皮细胞的作用不可忽视。表皮细胞、口腔黏膜上皮细胞,都曾被报道用于构建组织工程尿道的粘膜上皮层；脂肪干细胞、骨髓干细胞也被报道用于构建组织工程尿道的粘膜下层组织。组织工程尿道复合物构建时所使用的各种不同的细胞都有着各自不同的优势,但是,假如使用表皮细胞、口腔黏膜细胞,作为种子细胞,细胞的来源和细胞的数量都相对有限。因此,如果要保证组织工程尿道粘膜层的构建取得更加理想的效果,新的种子细胞来源是人们继续探索的重要内容之一。毛囊干细胞的来源相对丰富,毛囊干细胞的收集获取过程也相对比较容易,更重要的是毛囊干细胞与表皮干细胞的生物学特性十分相似,所以,毛囊干细胞是构建组织工程尿道的良好候选细胞；换言之,毛囊干细胞很有可能成为尿道组织工程种子细胞的新来源；虽然毛囊干细胞与表皮干细胞的生物学特性十分相似,但是,人们对毛囊干细胞与尿道粘膜干细胞的生物学表型差异还并不十分清楚,因此,探索与比较毛囊干细胞与尿道粘膜干细胞的生物学表型差异是正待解决的重要问题之一。而且,我们在上一部分研究中,已经建立了毛囊干细胞分选富集的方法,获得了质量相对稳定的毛囊干细胞,为本部分研究的开展奠定了基础。更重要的是,目前关于毛囊干细胞与尿道粘膜干细胞的生物学表型的比较研究也鲜有报道,我们需要进一步比较毛囊干细胞与尿道粘膜干细胞的生物学表型。种子细胞与支架材料是组织工程不可缺少的必要因素,组织工程支架材料分类方法有多种。根据材料来源可分为：天然支架材料与人工合成支架材料。组织工程天然材料的代表有：脱细胞真皮,煅烧珊瑚,脱细胞膀胱,脱细胞小肠粘膜下组织等等。人工合成支架材料代表有聚羟基乙酸,又名聚乙醇酸(Polyglycolic acids,PGA),聚乳酸(Polylactic acid, PLA),及聚羟基乙酸共聚物[Poly(D,L-lactic-co-glycolic)acid]PLAG,磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)等等。组织工程支架材料是根据材料用途,即应用于不同类型的人体组织,并根据其所具体将要替代的组织所要具备的功能而设计的。组织工程支架材料包括：皮肤、软骨、神经、血管、骨和人工器官,如肝、脾、肾、膀胱等。肝、胰、肾、泌尿系统使用的组织工程支架材料多为可降解材料,目前这方面研究和使用的材料,以天然蛋白质、多糖人工合成的高分子聚合物为主的可降解材料,例如：用于构建组织工程肝脏的支架的血浆纤维蛋白和聚乳酸,用于尿道组织工程的聚乙醇酸等。BAMG作为膀胱脱细胞基质与泌尿系统组织近似度极高,适用于尿道组织工程的构建。而BAMG作为天然脱细胞材料,其生物学性质也必须进行明确的研究。当种子细胞与生物材料的研究能够为组织工程尿道构建提供理论依据,以及参数指导后,我们就可以开展应用毛囊干细胞与BAMG构建组织工程尿道修复兔尿道缺损动物模型的实验研究。当然,我们研究的最终目的是将研究结果服务于临床。换句话说,关于毛囊干细胞以及膀胱脱细胞基质的研究基础,都应满足构建组织工程尿道的需要。综上所述,我们会在本研究中,探索利用毛囊来源的干细胞构建组织工程尿道的可行性,并将人工构建的组织工程尿道,用于兔尿道缺损的动物模型。为推动尿道组织工程的发展和应用提供参数和理论依据。希望最终能将该项目的研究成果早日应用于临床病人,服务人类、造福人类。目的我们进行此项研究的目的是探索体外分离、富集培养毛囊干细胞的优化条件,比较毛囊干细胞与尿道粘膜上皮来源干细胞的生物学特性差别,进一步研究毛囊干细胞的分化和构建组织工程尿道粘膜层的可行性,并最终应用于修复兔尿道缺损。为临床治疗尿道缺损,修复尿道提供理论依据及指导。方法本实验研究的毛囊干细胞来源于新西兰大白兔,以戊巴比妥静脉注射将兔麻醉后,在无菌条件下取兔双侧触须部全层皮肤。钝性分离单个毛囊组织。采用“两步酶”法从单个毛囊组织中获取单个细胞,并用于各种检测,或者将消化后的单细胞,以2×108/L密度接种到培养瓶中,置于5%CO2.37℃饱和湿度培养箱中培养,每3d换液,待细胞达到90%融合时按1：3传代。使用流式细胞仪分别分选直径10um且为CD200(+)/CD34(-)表型的毛囊干细胞与尿道黏膜上皮干细胞,分离培养兔毛囊干细胞与尿道黏膜上皮干细胞,体外原代培养扩增,记录并描绘兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的生长曲线,比较两种细胞的最大扩增倍数、克隆形成能力；使用流式细胞仪检测分选后两种细胞K19,p63,β1-integrin的阳性表达率。注射过量麻醉剂(戊巴比妥100mg/kg)处死实验动物兔,完整切取兔膀胱组织,将膀胱外翻,刮除黏膜层,在50m l磷酸盐缓冲液(PBS, pH值7.0,10mmol/L)和0.1%叠氮钠的混合液中搅拌5-6h,使细胞溶解,以去除基底膜和逼尿肌。用PBS漂洗,在50ml1mol/L NaC1溶液(含脱氧核糖核酸酶2000kU)中搅拌6-8h,使细胞彻底溶解,细胞组分完全释放。在50m l含4%脱氧胆酸钠和0.1%叠氦钠的混合液中搅拌5-6h,使细胞膜脂质双层和细胞内的膜脂质溶解。重复第3步骤制成BAMG。BAMG用PBS冲洗3次后贮存在10%新霉素溶液中。将分选富集的毛囊干细胞接种在组织工程支架材料上,构建组织工程尿道。体外尝试尿道黏膜上皮干细胞构建组织工程尿道。应用组织学、荧光染色法观察比较毛囊干细胞与尿道黏膜上皮干细胞体外构建的组织工程尿道的情况。利用扫描电镜观察各种不同类别组织工程尿道的细胞在支架上分布状态,将毛囊干细胞构建的组织工程尿道修复2.5cmm兔尿道缺损,组织学、尿道造影观察缺损修复情况。结果流式细胞仪显示：在所分析的样品中,存在明显的两群颗粒,一群为前向散射光参数分布较广泛的颗粒群,我们将其判断为细胞样品,另一群颗粒为小矩形区域内,前向散射光参数分布较集中的颗粒群,该群颗粒直径大小相对均一,而且同时表达三种荧光。毛囊干细胞经过流式细胞仪分选后,被移入直径10cm的培养皿中,然后置于倒置相差显微镜下观察。在同一放大倍数下,未分选的细胞群体,可见细胞直径大小不一。根据小细胞直径分选的细胞的群体,体积较小而且相对均一；根据大细胞直径分选的细胞的群体,体积较大而且相对均一。兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的最大扩增倍数分别为(6.1±0.8)×104倍和(7.1±1.1)×103倍。通过细胞标记、细胞大小、复合参数分选以及未分选的细胞群体克隆形成面积分别为：205.37±33.18(mm2),197.72±25.31(mm2),359.79±59.57(mm2),3.10±1.07(mm2)。复合参数分选的细胞群体克隆形成面积最大,并且与其余三组数据存在统计学差异(P0.05)。通过细胞标记(Marker sort)、细胞大小(Small size)、复合参数分选(Marker+small size)方式以及未分选(Unsort)而获得的细胞群体经过克隆染色后可见：复合参数分选所获得的细胞克隆数量及面积明显大于其它三组。未分选的细胞克隆数量不明显。毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞体外构建1个月的组织工程尿道HE染色。毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞在支架上都能形成复层上皮样结构,两类细胞所构建的组织在组织学上结构相似。粘膜下未见明显瘢痕组织增生富集毛囊干细胞表达K19,p63,β1-integrin,尿道支架具有良好的生物相容性,毛囊细胞在支架上形成复层上皮样结构AE1/AE3染色阳性。扫描电镜可见细胞与支架紧密贴附,适度伸展并有基质分泌,毛囊干细胞构建的组织工程尿道修复兔尿道缺损效果良好,而对照组为纤维瘢痕组织修复。毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞体外构建1个月的组织工程尿道免疫荧光AE1/AE3染色,可见在构建的上皮组织内明显有绿色荧光表达。组织工程支架材料的组织学染色结果显示脱细胞基质材料内未见细胞结构,材料中胶原纤维呈现天然的分布状态,纤维之间有可供细胞容纳的孔隙结构。单纯膀胱脱细胞材料的抗拉强度较高弹性模量与正常组织接近,能够满足组织构建对材料的需要。体外脱细胞基质材料细胞与毛囊干细胞共培养的结果显示,细胞与材料相容性良好,能充分粘附与材料表面,并正常分泌细胞基质；贴附于材料上的细胞能够自由迁移。植入动物体内的脱细胞材料未引起动物组织明显的免疫排斥反应,说明材料在处理过程中各种致炎物质已被彻底的处理。同时,也在体内进一步验证了膀胱脱细胞基质材料与体内细胞存在良好的细胞组织相容性。可见,细胞在支架上能形成复层上皮样结构,毛囊干细胞所构建的组织在组织学与正常尿道组织结构相似。粘膜下未见明显瘢痕组织增生。结论通过流式细胞仪对细胞表面标记以及细胞直径双重参数的优化,毛囊干细胞可以被分选富集。兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞具有相似表型,可以作为尿道组织工程种子细胞被用于构建组织工程尿道,在种子细胞获取方面,毛囊干细胞更优于尿道黏膜干细胞。富集的兔毛囊干细胞构建组织工程尿道修复效果优于未富集毛囊干细胞构建组织工程尿道的修复效果。应用富集的兔毛囊干细胞构建组织工程尿道可用于兔尿道缺损的修复治疗,修复效果良好,有进一步用于临床研究的可能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R699.6;R318.08

【参考文献】