基于柠檬酸的可注射自降解骨替代材料修复骨折的实验研究

发布时间：2018-05-14 16:32

本文选题：柠檬酸骨替代材料生物降解材料粉碎性骨折间充质干细胞 + 　；参考：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：背景：骨折是骨外科临床工作中最常见的疾患。骨质疏松、高能量外伤、肿瘤侵蚀是引发骨折的常见病因。对于简单骨折及其并发的小范围骨缺损而言,在有效复位和固定条件下,依靠骨组织较强的自我修复能力即可获得良好的骨折修复。然而,对于合并较大骨缺损的复杂骨折病例而言(如粉碎性开放骨折),单纯依靠骨组织的自我修复能力无法达到满意的骨折愈合效果。因此,以促进骨修复为目标,研发新型生物活性骨替代材料成为生物工程领域的重要研究方向。可注射的生物活性骨替代材料具有良好流动性与变形能力,能通过改变自身形态来修复骨折及骨缺损,因而被广泛看好。然而,当前已临床应用和尚处于实验研究阶段的可注射骨替代材料均受限于自身不足,不能仿生自然的骨替代生理过程。一方面,临床广泛应用的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate, PMMA)惰性骨水泥和磷酸钙(calcium phosphate cement,CPC)生物活性骨水泥虽然能弥合填充骨折块间的缺损、稳定骨折并提供良好力学支持,但其缓慢的自降解能力会阻碍骨替代材料被再生骨组织自然替代。另一方面,尚处于实验研究阶段的基于水凝胶的复合型骨替代材料,虽然具备较快的生物降解性,但与骨界面之间的粘附能力以及自身成骨诱导能力(不复合骨形态发生蛋白2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)等骨诱导因子情况下)并不令人满意。因此,临床亟需一种新型的可注射自降解骨替代材料,以期能同时具备下述方面的潜能：1)良好骨界面粘附性能,粘合并固定骨块；2)成骨诱导能力,材料自降解过程中缓释成骨诱导分子；3)材料快速自降解,促进生血管再生与新生骨替代进程。我们将具有成骨诱导潜能的柠檬酸分子和有较强粘附能力的左旋多巴分子通过化学反应整合入高分子聚合物的化学结构中,研发出一类新型自降解骨替代材料——生物仿生的基于柠檬酸的可注射生物胶黏剂-羟基磷灰石复合物(injectable citrate-based mussel-inspired tissue bioadhesive-hydroxyapitite composite, iCMBA/HA composite)。作为复合物中的重要组分,柠檬酸分子最近被发现在骨形成与骨矿化过程中有重要调控作用。Tran等报道柠檬酸能促进成骨细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和成骨分化转录因子(osterix, OSX)基因表达。Hu等发现柠檬酸可限制骨骼中磷灰石纳米晶体的过度增厚和生长,对于维持磷灰石纳米晶体结构及其力学性能发挥重要作用。Costello等认为成骨过程中发生的“柠檬酸化”过程与成骨细胞内柠檬酸代谢机制改变密切相关,在干细胞成骨诱导分化和骨形成过程中成骨细胞出现“柠檬酸化”(citration,即柠檬酸在细胞代谢过程中剩余并大量分泌出细胞外,随后沉积于细胞外基质)是不可或缺的重要阶段。这些发现提示：柠檬酸在骨形成与骨诱导过程中发挥着重要调控作用,并应该纳入骨替代物的设计。左旋多巴分子是复合物中的另一重要组分。作为生物粘合剂,左旋多巴分子最初提取自水生蚌壳类动物的分泌液。分泌的左旋多巴使得水生蚌壳类动物能在湿润界面上牢固的附着。它的这一特质给予我们灵感,促使我们将其化合入iCMBA聚合物结构中以增强材料的粘附强度。在本项研究中,围绕新型生物仿生的可注射生物胶黏剂-羟基磷灰石复合物(iCMBA/HA),我们进行系统的材料学表征、体外细胞学测试和体内动物学研究,验证其相关潜能并探讨可能的分子学机制,为后期临床试验提供坚实的实验室证据。目的：1)对iCMBA预聚物和iCMBA/HA复合物进行固化时间、理化性质、力学性能以及体外矿化能力等方面的表征；2)通过体外细胞培养测试iCMBA/HA复合物的细胞相容性以及降解产物在成骨细胞增殖、分化方面的调控作用；3)在体内动物粉碎性骨折模型中测试iCMBA/HA复合物作为修复骨折的粘合性骨替代材料在新骨形成与骨结构重建中的作用；4)初步探讨柠檬酸(降解产物中的重要组分)在成骨细胞增殖与分化过程中的调节作用。方法：应用核磁共振氢谱、红外光谱、高分子聚合物理化降解实验和力学测试实验分别对iCMBA预聚合物和iCMBA/HA复合物进行化学基团、理化特性、力学性能以及体外矿化能力方面的表征,遴选出合适的iCMBA/HA复合物配方；通过体外细胞培养,利用噻唑蓝MTT细胞增殖实验和Live/Dead细胞活性实验分别测试iCMBA/HA降解产物对间充质干细胞和成骨细胞增殖与活性的影响,同时采用Western Blot免疫印迹和Elisa技术检测iCMBA/HA降解产物对成骨细胞骨相关标志蛋白(成骨分化转录因子Runx2、碱性磷酸酶ALP和骨钙素OCN)表达的调控作用；在新西兰大白兔桡骨粉碎性模型上测试iCMBA/HA修复骨折过程中对骨量、骨质强度和骨结构重建的作用：最后在细胞层面初步探讨iCMBA/HA重要降解产物,柠檬酸,对成骨细胞分化标志蛋白(Runx2和OCN)表达以及成骨细胞矿化功能的的调节作用。结果：1预聚物和复合物的表征A)化学基团表征：核磁共振氢谱图(1H-NMR)在6.7 ppm (a)区域出现低幅多峰值提示：多巴胺(Dopamine)成功键合进入预聚物的侧链基团,同时在傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectra, FTIR)结果中得到印证。B)固化时间表征：各组iCMBA/HA复合物的固化时间在159±8秒至247±13秒之间。随着羟基磷灰石(HA)比率的增加,复合物固化时间降低。而增加高碘酸钠(PI)的浓度可加速交联过程,缩短固化时间。C)理化性能表征：各组iCMBA/HA复合物的溶出物含量均较低,约为3%。iCMBA/HA70%(iCH70)复合物的溶胀比仅为110%,显著低于其他iCMBA/HA复合物(P均0.05)。在降解速度方面,iCH70复合物约30天可完全降解。D)力学性能表征：随着羟基磷灰石(HA)含量的增加,iCMBA/HA复合物的抗压缩强度及杨氏模量逐渐增加。当羟基磷灰石含量增至70%时,新鲜制备2小时的iCH70的抗压缩强度可达1.554±0.152 MPa,并且随着时间延长(制备后24,48小时),可分别增至2.592±0.253MPa和3.182±0.272MPa,高于iCH30和iCH50组,差异有统计学意义(p均0.05)。E)体外矿化表征：体外孵育1天,iCH70复合物样本表面未见钙沉积晶体形成。随孵育时间延长,磷酸钙晶体形成并逐渐生长,至孵育第5天可见明显晶体层。经X射线光电子能量色散谱(EDX)检测证实为磷酸钙晶体,量化Ca/P比率约为1.61。而未复合羟基磷灰石的纯iCMBA表面始终未见类似晶体形成。F)柠檬酸累积释放浓度表征：降解第2天,iCH70降解溶液中柠檬酸浓度已达200uM。随着时间延长,柠檬酸累积释放浓持续升高,第6天升至900uM,第10至22天进入平台期,柠檬酸释放浓度约1200uM。2体外细胞实验A) hMSC细胞相容性测试：各组iCMBA/HA溶出物溶液中hMSC的细胞活性处于72.510±3.374%与84.302±7.014%之间,溶出物溶液的hMSC细胞相容性好。随着溶出物溶液成倍稀释,hMSC细胞活性可继续攀升达90%以上。各组iCMBA/HA复合物的降解产物溶液中的hMSC细胞活性均高于PLGA降解溶液,70.846+5.162%。其细胞相容性优于被广泛应用并认可的PLGA.随着降解产物溶液成倍稀释,hMSC细胞活性可达95%以上。B)成骨细胞活性测试：iCH70降解产物溶液中,成骨细胞活性好,未见明显凋亡或死亡细胞。成骨细胞数量随时间延长持续增加。成骨细胞形态与hMSC细胞形态差异化逐渐明显,并出现聚集趋势。C)成骨分化蛋白水平检测：iCH70降解溶液中,分化早期的成骨细胞内成骨细胞分化转录因子(Runx2)表达水平上调,分化中后期的碱性磷酸酶(ALP)活性增加,分化后期的骨钙素(OCN)蛋白水平下调。D)成骨矿化检测：随着时间推移,iCH70降解溶液中成骨细胞外基质钙结节的数量逐渐增加,分化第14天钙结节数量最多。3体内动物实验A) Micro CT骨量量化分析：术后当日,iCH70组与空白对照组的局部骨矿总量(BMC)和骨密度(BMD)值无显著统计学差异(P均0.05)。术后4,8,12周,与空白对照组相比,iCH70组的局部骨矿总量(BMC)和骨密度(BMD)分别为387.167±9.827 mg和122.000±5.586 mg/cm3,417.000±21.043 mg和133.00±6.325 mg/cm3,427.000±17.413 mg和143.00±8.579 mg/cm3.但仅在术后4,8周,iCH70组的骨密度值与对照组间差异有统计学意义(P均0.05)。B)三点弯曲力学测试：术后4,8,12周,iCH70组桡骨愈合区的最大抗弯负载强度分别达到128.000±3.688,146.000±3.521,178.500±4.848N,均高于空白对照组,组间差异有统计学意义(P均0.05)。C)骨组织形态学染色分析：iCH70修复桡骨骨折过程中,iCH70复合物降解速度较快,30天几乎完全体内降解。骨愈合区内,有多量新生血管形成,未降解的HA颗粒逐渐纳入新生骨组织中。术后12周可见HA颗粒几乎完全被吸收进入新生骨组织,新生骨结构较空白对照组更为紧密厚实。4初步探讨柠檬酸对成骨增殖分化的调节作用A) hMSC细胞增殖的柠檬酸浓度安全窗测试：低浓度柠檬酸(20gM-2000μM)对hMSC的增殖无抑制作用；高浓度柠檬酸(10000μM至20000μM范围)对hMSC的增殖有抑制作用。hMSC增殖的柠檬酸浓度控制2000μM以下较为安全。B)柠檬酸调控成骨分化功能：柠檬酸(200μM)在成骨分化早期能上调Runt相关转录因子2 (Runx2)的表达水平,而在成骨分化的后期,抑制成骨细胞内的骨钙素(OCN)表达。C)柠檬酸调控成骨矿化功能：柠檬酸(200μM)能促进成骨分化后期细胞外基质中钙结节的形成。结论：基于柠檬酸的可注射自降解生物粘附性材料-羟基磷灰石复合物(iCMBA/HA)具有良好的可操作性、合理的降解速率和力学支撑强度,与hMSC细胞相容性好,能促进成骨细胞的体外分化与矿化,促进骨折区骨量增加和骨力学强度恢复,是良好的可注射生物降解活性骨替代物,可用于粉碎性骨折等复杂骨折与骨缺损的修复治疗。柠檬酸,作为复合物中的最重要的降解产物,在成骨细胞增殖分化与矿化过程中起重要调控作用。
[Abstract]:Background : Fracture is one of the most common diseases in the clinical work of bone surgery . Bone loss , high energy trauma , and tumor erosion are the common causes of fracture .
2 ) osteogenic induction capability , and the material is slowly released into bone inducing molecules during self - degradation ;
3 ) The rapid self - degradation of the materials promotes the regeneration of raw blood vessels and the replacement of the new bone . We have developed a new type of biodegradable injectable bioadhesive - hydroxyapitite composite ( iCMBA / HA composite ) based on citric acid , which is a new type of self - degradable bone substitute material , biosimilar , into the chemical structure of the polymer polymer through chemical reaction . As an important component of complex , citric acid molecule has recently been found to play an important role in bone formation and bone mineralization . It has been found that citric acid plays an important role in promoting osteoblast alkaline phosphatase ( ALP ) and osterix , OSX gene expression .
2 ) the cell compatibility of the iCMBA / HA composite and the regulation effect of the degradation products on the proliferation and differentiation of osteoblasts are tested through in vitro cell culture ;
3 ) the role of iCMBA / HA complex in the reconstruction of new bone formation and bone structure is tested by testing iCMBA / HA composite in animal comminuted fracture model in vivo ;
4 ) The effects of citric acid ( important components in degradation products ) on proliferation and differentiation of osteoblasts were investigated .
The effects of iCMBA / HA degradation products on the proliferation and activity of mesenchymal stem cells and osteoblasts were tested by MTT cell proliferation experiment and Live / Dead cell activity experiment . Western Blot and ELISA were used to detect the expression of bone - related marker protein ( osteogenic differentiation transcription factor Runx2 , alkaline phosphatase ALP and bone calcium OCN ) .
The effect of iCMBA / HA complex on bone mass , bone strength and bone structure remodeling was studied in this paper . The results showed that the concentration of iCMBA / HA composite was lower than that of other iCMBA / HA complexes . Bone mineral density ( BMC ) and bone mineral density ( BMD ) of iCH70 group were significantly higher than those in control group ( P < 0.05 ) .
Conclusion : citric acid ( 200 渭M ) can increase the expression level of Runt - related transcription factor 2 ( Runx2 ) at the early stage of osteogenic differentiation .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R683;R318.08

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