戊二醛、肝素交联修饰改性肾脏脱细胞支架的试验研究

发布时间：2018-06-28 05:18

本文选题：去细胞 + 肾脏支架　；参考：《遵义医学院》2017年硕士论文

【摘要】：目的:通过灌注法制备戊二醛、肝素交联改性去细胞全肾支架,以提升去细胞肾支架的降解时间、生物力学性能及抗凝等指标,以更接近临床需要。方法:1.实验分组SD大鼠160只,随机分为4组,每组40只,第一组(D组):去细胞肾支架;第二组(G组):去细胞肾脏支架交联戊二醛;第三组(H组):去细胞肾脏支架交联肝素;第四组(G+H组):去细胞肾脏支架交联戊二醛后再交联肝素。2.制备各组去细胞肾脏支架SD大鼠腹主动脉行留置针置管,经下方腹主动脉置入2号留置针并固定,剪破上、下腔静脉促使血液尽快流出,连接蠕动泵,各组肾脏相应被依次灌入0.01%肝素溶液、1%Triton X-100、0.8%十二烷基硫酸钠(SDS)、去离子水,0.625%戊二醛(GA)、0.002%肝素钠溶液及含有双抗(青霉素-链霉素)的去离子水,各组获得去细胞肾脏均浸泡于生理盐水4℃冰箱存储备用。3.病理学观察(1)大体观察肾脏外形及颜色差异变化;(2)HE染色、masson染色及扫描电镜观察各组去细胞肾脏组织胶原形态微结构;4.生物力学结构稳定性观察(1)通过体外降解率、吸水率对支架内部结构进行稳定性评估(2)通过生物力学检测,包括:极限抗张强度(Mpa)、断裂伸长率(%)及弹性模量5.抗凝性观察(1)甲苯胺蓝染色观察去细胞肾支架是否成功交联肝素;(2)血小板黏附试验将各组去细胞肾支架切取成0.5cmx0.3cm大小组织块,放入富血小板血浆内震荡6h,取出后依次通过去离子水浸泡、0.5%戊二醛固定、梯度脱水、干燥、镀金,最后在电子扫描电镜观察样本采集图像。6.组织相容性检测大鼠背部正中线两侧取1cm大小切口切开分离至皮下深筋膜层构建四个囊袋,分别植入四组标本(1/4单肾),于3D,1W,2W,4W,8W取出皮下植入支架组织,行HE染色观察支架内部炎症反应及血管生成情况;7.细胞相容性(1)CCk-8细胞增殖-毒性检测第一步:制作标准曲线细胞计数板计数所制备细胞悬液中的细胞数量,将该细胞悬液等比稀释成3-5个细胞浓度梯度(每组做4个复孔)接种于96孔板,37℃5%CO2培养箱孵育2h见细胞贴壁,加入cck-8(10ul)培养2h,酶标仪测定450nm吸光度(OD值),制作标准曲线,其中,X轴:细胞数量;Y轴:OD值。第二步:样本的测定及检测各组肾支架行冰冻切片(厚10um)贴附于六孔板爬片备用,血管内皮细胞计数后(平均7-10×104/ml)制成细胞悬液,分别接种于备用爬片及空白爬片并置入37℃5%CO2培养箱孵育7D,5D,3D,2D,1D,每孔加入200ul cck-8溶液,置入培养箱孵育2h,移液枪移入96孔板,酶标仪测定450nm吸光度,根据标准曲线计算细胞存活率、抑制率。(2)免疫荧光染色各组肾支架行冰冻切片(厚10um)贴附于六孔板爬片备用,血管内皮细胞计数后(平均7-10×104/ml)滴于爬片共培养,三天后取出行免疫荧光染色观察,PBS清洗残余培养基,甲醛固定后,血清封闭,滴加一抗(Collagen IV抗体抗鼠、sma抗体抗兔)置入暗盒于4℃冰箱孵化过夜,次日滴加二抗(755绿光抗鼠,694红光抗兔)及DAPI复染后荧光显微镜下观察。结果:1.大体观察各组去细胞肾支架保存肾脏原有外形,D组呈半透明白色,稍塌陷,其余三组去细胞肾支架形态较未交联前更立体,交联戊二醛后的去细胞肾支架颜色呈淡黄色。2.病理学观察HE染色及Masson染色观察可见各组细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)成分完整,胶原无断裂,清晰可见明显类似肾小球、肾小管、血管结构轮廓,纤维及基膜等机构连续完整,肾小球及肾小管内均未见细胞残留结构;扫描电镜清晰可见未交联组和交联组去细胞肾支架上未见细胞残留,胶原连续连接,无断裂,交联组可见支架上附着各对应的药物颗粒。3.生物力学及组织稳定性观察G+H组及G组肾支架降解率远低于D组肾支架(P0.05);D组吸水率(94.88%)高于G组(88.14%)及G+H组(88.72%)(P0.05);戊二醛交联后提高了肾支架的力学性能,包括:极限抗张强度和弹性模量(P0.05)。4.抗凝性观察肝素交联(H组和G+H组)去细胞肾支架上未见明显血小板黏附,而未进行肝素交联(D组,G组)肾支架布满血小板。5.组织相容性观察背部皮下包埋结果显示未进行交联的肾支架在包埋两周便开始降解,通过GA交联后肾支架包埋4周才出现降解现象,各组包埋肾支架内部均可见新生血管。6.细胞相容性观察CCK-8试验提示各组的去细胞肾支架和血管内皮细胞共培养后,均未产生细胞毒性,同时与空白组相比较,表现出一定的促细胞增殖作用。各实验组与对照组去细胞肾支架分别与肾的血管内皮细胞共培养三天后行免疫荧光染色显示,细胞均能良好的贴附于支架生长,表现出良好的细胞相容性。结论:1.与单纯去细胞肾支架相比较,通过灌注法制备的戊二醛、肝素交联的去细胞肾支架具有外形更为立体,更长的体内外降解时间、及更稳定的生物力学性能;2.相比较于单纯去细胞肾支架,肝素交联修饰后的去细胞肾支架具备一定的抗凝性能;3.通过戊二醛、肝素交联的去细胞肾支架仍能保留去细胞生物肾支架特有的良好组织相容性和细胞相容性。
[Abstract]:Objective : To prepare glutaraldehyde and heparin cross - linked modified acellular renal scaffold by perfusion method . The results were as follows : 1 . There was no obvious platelet adhesion on the renal stents in group D and G + H group . The results were as follows : 1 . There was no obvious platelet adhesion on the kidney support of group D and G + H group . Conclusion : 1 . Compared with the simple acellular kidney stent , the acellular kidney stent crosslinked by heparin has a more stereo , longer in vivo external degradation time and more stable biological mechanical property ; 2 . Compared with the simple acellular kidney bracket , the acellular kidney stent after heparin crosslinking has certain anticoagulation performance ; 3 . The acellular kidney stent crosslinked by heparin can still retain the specific good tissue compatibility and cell compatibility of the acellular biological kidney scaffold .
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

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