女性生育力保存方法探索：ICSI周期中未成熟卵母细胞的再利用研究

发布时间：2018-10-08 08:42

【摘要】：目的探讨低氧（5%O_2）环境及个体化体外成熟方案对控制性超排卵周期中人未成熟卵母细胞IVM结果的影响。方法共收集ICSI周期中成熟失败人卵母细胞556枚，并随机分为两组：常氧组（20%O_2）319枚未成熟人卵母细胞，行IVM；低氧组（5%O_2）237枚未成熟人卵母细胞。经体外培养，成熟后卵母细胞行ICSI。ICSI后16~18h观察第二极体排出及原核形成情况，挑选出正常受精卵继续培养至扩张囊胚，期间观察和记录IVM后卵母细胞的成熟、2PN、2PN卵裂、D3-优质胚胎、囊胚、优质囊胚数目并计算相应的比率。根据未成熟卵体外成熟方案，常氧组（20%O_2）和低氧组（5%O_2）又分别被随机分成两组：常规IVM组未成熟人卵母细胞入IVM液，在37℃、6%CO_2、20%O_2及饱和湿度的条件下培养，36h后体视显微镜下挑选出发育至MII期的卵母细胞，随后行ICSI；个体化IVM组人卵母细胞在相同条件下培养4h后，每间隔2h在倒置显微镜下观察卵母细胞第一极体排出情况，挑出排出第一极体的卵母细胞入受精液中，同一条件下培养4h后行ICSI，剩余未成熟卵重复以上的观察和处理，整个试验中未成熟卵的最长体外成熟时间限定为36h。ICSI后16~18h观察第二极体排出及原核形成情况，挑选出正常受精卵继续培养至扩张囊胚，期间观察和记录IVM后卵母细胞的成熟、2PN、2PN卵裂、D3-优质胚胎、囊胚、优质囊胚数目并计算相应的比率。试验中所有的优质囊胚均行两轮FISH共8种染色体（13，15，16，18，21，22，X，Y）进行检测。第1轮FISH13、21、22、16、18探针分别被红、绿、金、青、蓝荧光所标记，第2轮FISH15、X、Y探针分别被绿，橙，青荧光所标记。结果常氧组（20%O_2）：GV期+MI期卵母细胞319枚，IVM成熟258枚，ICSI后受精227枚，双原核（2PN）201枚，2PN卵裂184枚，D3-优质胚胎30枚，囊胚22枚，其中优质囊胚4枚；低氧组（5%O_2）：GV期+MI期卵母细胞237枚，IVM成熟194枚，ICSI后受精179枚，双原核（2PN）162枚，2PN卵裂153枚，D3-优质胚胎53枚，囊胚37枚，其中优质囊胚9枚。两组间比较：成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率及优质囊胚率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05），D3-优质胚胎率及囊胚率呈极显著性差异（P＜0.01，x2＝15.13; P＜0.01，x2＝8.65）。20%O_2培养条件下，常规IVM组卵母细胞112枚，IVM成熟94枚，ICSI后受精84枚，双原核（2PN）76枚，2PN卵裂70枚，D3-优质胚胎10枚，囊胚6枚，未获得优质囊胚；个体化IVM组卵母细胞207枚，IVM成熟164枚，ICSI后受精143枚，双原核（2PN）125枚，2PN卵裂114枚，D3-优质胚胎20枚，囊胚16枚，其中优质囊胚4枚。两组间比较：成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率、D3-优质胚胎率、囊胚率及优质囊胚率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05），但个体化IVM组的囊胚率及优质囊胚率明显高于常规IVM组（14.0%Vs8.57%；25.0%Vs0）。5%O_2培养条件下，常规IVM组卵母细胞100枚，IVM成熟78枚，ICSI后受精72枚，双原核（2PN）68枚，2PN卵裂65枚，D3-优质胚胎10枚，囊胚6枚，其中优质囊胚2枚；个体化IVM组卵母细胞137枚，IVM成熟116枚，ICSI后受精107枚，双原核（2PN）94枚，2PN卵裂88枚，D3-优质胚胎43枚，囊胚31枚，其中优质囊胚7枚。两组间比较：成熟率、受精率、2PN率、2PN卵裂率及优质囊胚率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05），D3-优质胚胎率及囊胚率呈极显著性差异（P＜0.01，x~2＝18.51; P＜0.01，x~2＝13.78）。试验中共获得13枚优质囊胚，均成功固定，低氧组（5%O_2）获得9枚优质囊胚，非整倍体胚胎4枚，非整倍体发生率44.4%。常氧组（20%O_2）获得4枚优质囊胚，异常2枚，异常率50%。两组异常胚胎率相当，差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论低氧（5%O_2）的体外培养环境及有利于ICSI周期人未成熟卵母细胞的体外成熟、受精及所获胚胎的发育；个体化的体外成熟方案有利于人未成熟卵母细胞体外成熟及受精后所获胚胎的发育；ICSI周期中人未成熟卵母细胞通过IVM，ICSI及早期胚胎培养能获得八种染色体正常的优质囊胚。总之，控制性超促排卵周期中人未成熟卵母细胞在5%O_2浓度的体外培养条件下，经过个体化方案的体外成熟，受精及早期胚胎培养能获得较为满意的IVM结果，实现了未成熟卵母细胞的再利用。一、冷冻方式对ICSI周期人未成熟卵母细胞冻融后发育潜力的影响研究目的冷冻方式对ICSI周期中人未成熟卵母细胞冻融后存活、成熟、受精、胚胎发育的影响。方法共收集ICSI周期中成熟失败人卵母细胞454枚，并随机分为两组。慢速冷冻组：192枚未成熟卵母细胞，其中GV70和MI122枚，行人未成熟卵冻融；玻璃化冷冻组：262枚卵母细胞（GV92枚，MI170枚）。未成熟卵冻融后，挑选出存活的卵母细胞行体外成熟培养，成熟后卵母细胞行ICSI，ICSI后16~18h观察第二极体排出及原核形成情况，挑选出正常受精卵继续培养至扩张囊胚，期间观察和记录卵母细胞的存活、成熟、2PN、2PN卵裂、D3-优质胚胎、囊胚、优质囊胚数目并计算相应的比率。结果慢冷组卵母细胞（GV+MI）冻融后的总存活率显著低于玻璃化组（62.0%Vs82.4%），且经统计学检验呈显著性差异（P＜0.01,2＝23.99）。慢冷组GV，MI卵母细胞存活率分别为85.7%和48.4%，玻璃化组分别为93.5%和76.5%。综合两组，GV期卵母细胞冻融后存活率显著高于MI期卵母细胞（90.1%Vs64.7%），且经统计学检验呈显著性差异（P＜0.01，X~2＝34.75）。慢冷组冻融后GV,MI期卵母细胞IVM的成熟率分别是16.7%（10/60）和50.8%（30/59），而玻璃化组分别是24.4%和55.4%。综合两组，冻融后总的GV期卵母细胞经过36h IVM培养获得21.2%的体外成熟率，显著低于总的MI的体外成熟率（54.0%），差异有显著性（P＜0.01，x~2＝36.87）；慢冷组119枚存活的卵母细胞（包括GV+MI）中，40枚发育成熟；玻璃化组216枚中，93枚成熟。成熟率方面：玻璃化组的43.1%（93/216）高于慢冷组的33.6%（40/119），但两者之间经统计学检验无显著性差异（P＞0.05，X~2＝1.26）。慢冷组10枚冻融后GV期卵母细胞IVM成熟后ICSI，没有获得受精；而玻璃组21枚GV期卵母细胞经IVM成熟后获得受精卵4枚，受精率为19.0%。冻融后MI期卵母细胞经IVM成熟后ICSI，其中，慢冷组12枚受精，受精率为36%（12/30），玻璃化组44枚受精，受精率是61.1%（44/72），但两组MI期卵母细胞经IVM后ICSI，受精率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05）。综合两组，冻融后MI期卵母细胞经IVM成熟后ICSI，其受精率（58.8%）显著高于GV期卵母细胞经IVM后ICSI的受精率（12.9%），差异呈极显著性（P＜0.01，X~2＝8.61）。在玻璃化组，冻融后GV期卵母细胞最终未获得卵裂期胚胎。在慢冷组，冻融后MI期卵母细胞获得12枚受精卵，体外培养后最终获得2枚卵裂期胚胎，但均发育阻滞于2细胞阶段；而在玻璃化组，冻融后MI期卵母细胞行IVM后ICSI及体外培养后获得22枚卵裂期胚胎，并最终获得5枚囊胚。提示MI期卵母细胞IVM后行ICSI所获得的胚胎卵裂率，玻璃化组显著高于慢速冷冻组（50.0%Vs16.7）。结论冻融人未成熟卵母细胞，玻璃化冷冻法优于慢速冷冻法，且GV期卵母细胞比MI期卵母细胞更能耐受低温和冷冻保护剂的影响，但MI期卵母细胞玻璃化冻融后经IVM、ICSI及胚胎培养能获得较为满意的胚胎。二、乙醇激活/海藻糖应用与ICSI周期人未成熟卵母细胞冻融后发育潜力目的乙醇激活及海藻糖应用对ICSI周期中人未成熟卵母细胞冻融后存活、成熟、受精、胚胎发育及胚胎非整倍体发生的影响方法纳入本试验中所有成熟失败人卵母细胞被随机分为：蔗糖玻璃化组，274枚未成熟卵使用含蔗糖为冷冻保护剂的冻融液进行冻融研究；海藻糖玻璃化组，245枚未成熟卵使用含海藻糖为冷冻保护剂的冻融液进行冻融；对照组（新鲜组），291枚未成熟卵未经冷冻直接行体外成熟培养。随后又根据体外成熟卵ICSI后是否进行乙醇激活，将以上三个研究组进一步分成六组，分别为：蔗糖玻璃化未激活组，蔗糖玻璃化激活组；海藻糖玻璃化未激活组，海藻糖玻璃化激活组，新鲜未激活组及新鲜激活组。期间观察和记录冻融后卵母细胞的存活、成熟、2PN、2PN卵裂、D3-优质胚胎、囊胚、优质囊胚数目并计算相应的率。试验中所有的优质囊胚均行两轮FISH共8种染色体（13，15，16，18，21，22，X，Y）进行检测。第1轮FISH13、21、22、16、18探针分别被红、绿、金、青、蓝荧光所标记，第2轮FISH15、X、Y探针分别被绿，橙，青荧光所标记。结果新鲜未激活组（GV+MI）：112枚卵直接行IVM方案，94枚成熟，76枚受精，70枚卵裂，优质胚胎10枚及形成囊胚6枚，未获优质囊胚；新鲜激活组（GV+MI）：179枚未成熟卵，IVM成熟152枚,，ICSI后行乙醇激活，激活后受精130枚,卵裂率124枚,优质胚胎39枚，形成囊胚25枚及优质囊胚14枚。蔗糖玻璃化未激活组（GV+MI）：未成熟卵母细胞128枚，解冻后存活110枚，IVM成熟100枚，ICSI后受精82枚,卵裂48枚，未获优质胚胎及囊胚；蔗糖玻璃化激活组（GV+MI）：未成熟卵母细胞146枚，解冻后存活124枚，IVM后成熟104枚，ICSI卵激活后受精86枚,56发生卵裂,形成优质胚胎16枚，，形成囊胚8枚，其中优质囊胚4枚。新鲜激活组与新鲜未激活组比较：成熟、受精及卵裂率之间无差异（P＞0.05），优质胚胎率经统计学检验呈显著性差异（31.5%Vs14.3%，P＜0.01， X~2＝6.98），囊胚率及优质囊胚率间差异有统计学意义（20.2%Vs8.6%，P＜0.05，X~2＝4.48；56.0%Vs0，P＜0.05， X~2＝6.13）；玻璃化未激活组与玻璃化激活组比较，优质胚胎率及囊胚率分别经统计学检验呈显著性差异（28.6%Vs0%，P＜0.01，X~2＝16.21；14.3%Vs0，P＜0.01，X~2＝7.43），且激活组获得4枚优质囊胚。新鲜激活组与玻璃化激活组相比：成熟、受精，优质胚胎，囊胚及优质囊胚率之间无差异（P＞0.05），但新鲜组卵裂率（95.4%）显著高于玻璃化组（65.1%），经统计学检验呈显著性差异（P＜0.01，X~2＝34.14）；新鲜未激活组和玻璃化未激活组相比：新鲜组卵裂率，优质胚胎率及囊胚率分别高于玻璃化组（92.1%Vs58.5%；14.3%Vs0；8.6%Vs0），差异分别有统计学意义（P＜0.01，X~2＝23.51；P＜0.01，X~2＝7.49；P＜0.05，X~2＝4.33）。海藻糖玻璃化组：125枚未成熟卵，冻融后108枚存活，IVM后98枚成熟，ICSI后82枚受精，培养后45枚发生卵裂，5枚发育为优质胚胎，3枚发育至囊胚，但未获得优质囊胚；海藻糖玻璃化激活组：未成熟卵母细胞120枚，解冻后存活100枚，IVM后成熟87枚，ICSI卵激活后受精70枚,38枚发生卵裂,形成优质胚胎13枚，囊胚形成10枚，其中优质囊胚6枚。海藻糖玻璃化组与蔗糖玻璃化组相比：存活、成熟、受精，卵裂、优质胚胎，囊胚及优质囊胚率之间无差异（P＞0.05），同样海藻糖玻璃化组与蔗糖玻璃化激活相比各参数间也无差异（P＞0.05）。新鲜激活组和玻璃化激活组共获得X~24枚优质囊胚，均成功固定，新鲜组14枚优质囊胚，异常胚胎5枚，异常胚胎率35.7%；蔗糖玻璃化激活组4，异常3枚，非整倍体发生率75%；海藻糖玻璃化激活组6枚，3枚被检测出为非整倍体，发生率50%。分别与新鲜组相比，非整倍体率相当，无差异（P＞0.05）。结论ICSI周期中人未成熟卵母细胞在冻融过程中遭受损伤，降低其形成胚胎的潜力，人工辅助激活不能促进胚胎的形成，但有利于所获胚胎后期更好的发育；在人未成熟卵母细胞的冻融过程中，与蔗糖相比其冻融效果相当。目的通过共聚焦显微镜观察人未成熟卵母细胞经IVM获得成熟卵子冻融后超微结构的状态，旨在分析此类卵子在冻融过程中的冷冻损伤。方法共收集62枚新鲜人未成熟卵母细胞，行IVM，51枚发育至MII期，选出42枚形态正常的MII卵随机分为两组：IVM-蔗糖组，20枚卵经过含蔗糖的玻璃化液冻融后行共聚焦显微镜观察，分析纺锤体结构变化；IVM-海藻糖组，22枚应用海藻糖玻璃化液冷冻；对照组，共收集X~20枚IVF周期中形态正常的MII卵（患者鉴定知情同意，同意赠卵）：2枚直接行固定和随后的纺锤体观察，另18枚，9枚行蔗糖，9枚行海藻糖玻璃化冻融及纺锤体观察。结果IVM成熟卵母细胞42枚，20枚应用蔗糖玻璃化液冷冻，解冻后，存活17枚（IVM-蔗糖组）；22枚应用海藻糖玻璃化液冷冻，解冻后，存活19枚（IVM-海藻糖组）；IVF-蔗糖组成活8枚，IVF-海藻糖组存活8枚。四组间的存活率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05），四组存活的卵母细胞分别固定染色体，有效固定的卵母细胞数分别为：IVM-蔗糖组10枚，IVM-海藻糖组11枚，IVF-蔗糖组6枚及IVF-海藻糖组7枚，染色体与纺锤体形态结构均正常分别有3枚（30.0%）、4枚（36.4%）、4枚（66.7%）和5枚（71.4%）。四组间纺锤体及染色体正常形态率经统计学检验无显著性差异（P＞0.05）。结论应用海藻糖作为非渗透性保护剂行玻璃化冻融人成熟卵母细胞可能有利于保护纺锤体形态结构；人卵母细胞玻璃化冻融过程中，体外成熟卵和体内成熟卵冻融后均存在更严重的结构损伤，但体内成熟卵母细胞似乎具有更强的抗冻性。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.52

【参考文献】