携带重组人胰岛素基因的脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架构建组织工程脂肪的实验研究

发布时间：2018-10-11 09:29

【摘要】：目的：探讨携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)与丝素蛋白支架在体内外构建组织工程化脂肪的可行性。方法：1.以最适MOI=10重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转染hUCMSCs(A组),EGFP基因转染组(B组)作为对照；将两组细胞接种于丝素蛋白支架,荧光倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的生长及黏附情况；尔后行细胞-支架复合物成脂诱导,5-7d后,油红O染色、RT-PCR检测观察成脂情况。2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转染对hUCMSCs生长增殖的影响,分为转染组和未转染组。3.MTT法测定基因转染的hUCMSCs在丝素蛋白支架上的活性,分为细胞组与细胞支架组。4.将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体以最适MOI=10转染hUCMSCs,将转染组与未转染组(对照组)的hUCMSCs分别接种于丝素蛋白支架,在体外含10%FBS的LG-DMEM培养基中孵育1-2d,在成脂诱导剂中孵育5-7d后,移植于Wistar大鼠背部皮下；移植后12周取材,行荧光原位杂交技术鉴定与组织形态学和扫描电镜观察。结果：1.A、B两组细胞-支架复合物成脂诱导5-7d后,扫描电镜见细胞与支架黏附良好并有大量基质分泌,油红O染色见丝素蛋白支架内已有脂肪样细胞生成,并与丝素蛋白支架牢固粘附,A组脂肪样细胞数量明显多于B组,有显著统计学差异(P=0.007, P0.01); RT-PCR检测证实经诱导的A、B组hUCMSCs均表达成脂特异性基因PPARy-2,且A组PPARy-2基因表达更强于B组,而未经诱导的hUCMSCs(阴性对照)表达为阴性。2.MTT法检测结果显示,转染重组慢病毒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP的hUCMSCs与未转染组各时间点D值比较差异均无统计学意义(P=0.056,P0.05),说明以携带重组人胰岛素基因的慢病毒载体转染hUCMSCs对其生长增殖无明显影响。3.细胞组与细胞支架组D值比较无统计学意义(P=0.066,P0.05),表示丝素蛋白支架对基因转染后的hUCMSCs的生长活性无明显影响。4.油红O染色显示,两组移植物均呈阳性,证明移植物已在体内分化为脂肪组织,且转染组脂肪样细胞数量明显高于对照组,有显著性统计学差异(0.01)；HE染色显示,两组移植物组织结构与正常脂肪组织相似,组织内及其周围可见明显新生血管,未降解支架材料周围有炎性细胞浸润,转染组支架材料降解明显,炎性细胞浸润明显少于对照组,新生血管数量也多于对照组；扫描电镜观察提示,两组移植物内可见脂肪样细胞和新生血管,转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团,其结构与正常脂肪组织相似,而对照组脂肪样细胞散在分布于支架孔隙内。结论：1.胰岛素基因能明显促进hUCMSCs成脂肪化,携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的hUCMSCs能有效地与丝素蛋白支架在体外构建组织工程化脂肪。2.携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的hUCMSCs与丝素蛋白支架复合后,在Wistar大鼠体内能构建出组织工程化脂肪组织,其结构类似正常脂肪组织。
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【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.1

【参考文献】