VEGF-PLA纳米缓释微球与SVFs对游离移植脂肪颗粒及脂肪组织工程胶原支架血管化的研究

发布时间：2018-10-20 20:45

【摘要】：研究背景组织工程技术是近来学术界研究热点,细胞疗法和基因疗法是组织工程研究的热点,学术界一直探求一种临床实用性强的安全的辅助组织工程手段。近年来,随着脂肪抽吸术的广泛开展和应用,自体脂肪颗粒注射移植术已经在国内外得到广泛的重视。自体脂肪颗粒以其无排斥、感染率低、注射后组织相容性好等优点,是目前修复软组织缺损比较理性的填充材料。虽然脂肪组织工程技术理论的发展,为真正实现无损伤修复软组织缺损和真正意义上形态、结构与功能重建开辟了新的途径。但是,脂肪组织工程技术目前还不能实现临床应用,所以目前修复软组织缺损较理想的填充材料是自体脂肪颗粒。自体脂肪颗粒移植在临床上一直备受关注,尤其是负压抽脂术在临床上得到广泛的应用之后,这种移植术被越来越多的临床医生和患者所接受,并在获取、纯化、注射脂肪和提高其存活率等方面不断得到提高。但是,自体脂肪颗粒移植后吸收率可高达30%-50%,这种高吸收率的问题一直不能得到良好的解决,所以移植脂肪成活率较低极大地限制了其在临床上的广泛应用。脂肪组织不仅是储存能量及内分泌器官,还是软组织填充理想的替代物,而且还被认为是成体干细胞的有效来源,因为脂肪组织当中含有多种细胞成分,包括祖细胞成分,这些祖细胞成分可分化成为其他细胞系。脂肪组织当中主要包含脂肪细胞、脂肪干细胞、血管内皮细胞、壁细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及细胞外基质成分等,其中脂肪细胞和脂肪干细胞是近年来研究的热点。脂肪干细胞被认为是一种表现脂肪细胞和血管细胞的祖细胞,它位于脂肪细胞之间、血管周围或细胞外基质中,可促进脂肪组织的转归。脂肪干细胞存在于脂肪组织的间质血管碎片中(stromal vascular fraction,SVF),而SVF是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化,从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片(SVF)。间质血管碎片中含有丰富的间充质干细胞,可分化为多种谱系,是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞。选择合适细胞外基质支架,作为妥当的细胞载体是组织工程的关键,是使SVFs中的ADSCs得以增殖、分化的重要条件。脂肪组织本身含有非常丰富的胶原、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白等,这些组织是优秀的细胞外基质。这些年来热门的SVFs细胞辅助脂肪转移技术,既解决了移植脂肪中ADSCs含量低,同时又解决了移植的SVFs缺乏细胞外基质两个问题,并简化了SVFs提取的体外培养、多次离心重悬等步骤,为临床上解决移植脂肪吸收率高的难题提供了一种解决方法。在组织工程材料中加入有活性的生长因子,能够增强工程化组织的血管化,减少吸收率,提高移植组织的成活。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)又称为血管渗透因子,这种细胞因子具有促进血管渗透的作用,同时还可促进血管内皮细胞增殖和迁移、延长血管内皮细胞寿命、促进血管形成、增强血管通透性和改变细胞外基质等作用。除了对血管的作用,它还与创面愈合、创伤组织修复、炎症和肿瘤发生密切相关。VEGF与VEGF受体之间存在正反馈,VEGF因子局部应用可以诱导血管内皮细胞VEGF及其受体的高表达,导致VEGF效应的放大。但是VEGF在体内应用时因其半衰期短、容易降解等因素使得不能充分发挥其生物学效应。药剂学的缓释技术很好的解决这一难题,它通过微球包埋技术将VEGF包埋于聚乳酸纳米微球中,从而使这种细胞因子能够缓慢的释放,达到对周围环境持续发挥生物学效应的目的。这种缓释技术在脂肪组织工程的研究领域具有很大的研究价值。近年来,组织工程技术的发展迅速,使得很多临床上的难题获得了一种可能性的解决方案。然而,由于组织工程的血管化问题难以解决,大部分的组织工程技术距离临床应用还有很大距离。胶原蛋白是良好的支架材料,其已被美国FDA批准作为人工皮肤材料。对于种子细胞的选择,大部分研究都选择脂肪干细胞。然而由于脂肪干细胞需要培养周期,且操作复杂,临床应用性不强。SVFs作为种子细胞,具有很多优势。以胶原蛋白作为支架材料,以SVFs作为种子细胞构建工程化的脂肪组织,并且以VEGF-PLA缓释微球作为微环境细胞因子,国内外尚未见相关报道。研究目的 1.临床指导上：希望通过探讨VEGF-PLA纳米缓释微球与SVFs对游离移植脂肪颗粒及脂肪组织工程胶原支架血管化的影响。探索一种临床应用性强的辅助脂肪移植和脂肪组织工程的细胞疗法和基因疗法手段。为下一步将科学研究应用于临床做好理论基础。 2.学术上：基因疗法的细胞因子缓释系统结合SVFs细胞疗法对游离脂肪移植及组织工程胶原支架血管化的研究,在国内外学术界尚未见报道。本研究希望通过对其机理的探讨,进一步揭示其机理,为临床应用做铺垫。本研究的创新点是,将SVFs与细胞因子缓释系统相结合,联合SVFs和(或)VEGF-PLA缓释微球体内构建工程化脂肪组织及辅助脂肪移植。同类的研究在学术界尚未见报道。具体的研究目的如下。 1.利用酶消化法从人脂肪组织当中分离提取SVFs,进行形态观察,并进行多向诱导分化,探讨其干细胞特性及作为脂肪组织工程理想种子细胞的优势。 2.体外DiI荧光标记SVFs,荧光显微镜观察细胞标记情况并检测DiI标记对SVFs培养贴壁所得PO代细胞增殖和成脂分化的影响,探讨DiI标记作为细胞示踪标记的优势。 3.体外构建VEGF-PLA聚乳酸纳米微球缓释系统,检测样品包封率和载药量,并检测其体外缓释能力,探讨其应用于辅助脂肪颗粒移植研究的可行性。 4.设计对照组,将SVFs和(或)VEGF-PLA缓释微球联合脂肪颗粒移植进行体内实验,探讨SVFs和(或)VEGF-PLA缓释微球对体内脂肪颗粒移植成活的影响。 5.以Ⅰ型胶原固态支架为载体材料,联合SVFs和(或)VEGF-PLA缓释微球体内构建工程化脂肪组织的影响,检测其体内构建脂肪组织的血管化水平,为脂肪组织工程提供实验依据。材料与方法 1.SVFs的体外分离培养及其培养所得未传代P0代细胞多向诱导分化鉴定收集抽脂术患者的脂肪组织,纯化后用Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心、铺皿进行贴壁培养,观察细胞生长状态。用MTT法绘制细胞增殖生长曲线;用相应的定向诱导液对SVFs培养所得未传代PO代细胞向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞方向诱导分化,并用油红O、茜素红和阿新蓝染色进行鉴定。 2. SVFs体外DiI荧光标记及观察标记物对SVFs培养所得未传代P0代细胞生物性状的影响荧光染料DiI体外标记SVFs,倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情况,分别用MTT法和油红O定量检测法检测DiI标记后SVFs培养所得未传代P0代细胞增殖能力和成脂分化能力,并与未标记组进行统计学比较,分析标记后细胞生物性状的改变。 3.体外构建VEGF-PLA缓释微球并检测其载药量、包封率及体外缓释特性体外用超声乳化法构建VEGF-PLA缓释微球,检测微球载药量和包封率；透射电镜观察微球包被情况并测量直径；用ELISA试剂盒检测VEGF-PLA缓释能力,连续检测21d,分析缓释微球的特性,为下一步实验提供依据。 4.SVFs及VEGF-PLA缓释微球对脂肪颗粒移植影响的体内实验研究分组设计：第1组移植单纯脂肪颗粒；第2组移植脂肪颗粒+SVFs,第3组移植脂肪颗粒+SVFs+VEGF-PLA缓释微球；体外将SVFs用DiI荧光标记,标记后分别按照分组将SVFs和(或)VEGF-PLA缓释微球与脂肪颗粒混匀,观察混匀后的性状,无菌条件下将混合物通过注射的方式随机注射入裸鼠皮下,每只裸鼠注射3个点。8w后取出移植物,准确测量湿重,记录数据并进行统计学比较,组织切片经HE和CD34及VEGF免疫组化染色分析,观察移植后脂肪颗粒存活情况,并观察CD34和VEGF的表达情况,显微镜下计数三组毛细血管数量,并进行统计学比较,分析SVFs和VEGF-PLA缓释微球对移植物血管化的影响。 5.VEGF-PLA缓释微球促进工程化脂肪组织血管化的影响研究准备三组移植物,1组为SVFs+胶原支架,未体外成脂诱导。2组为SVFs+胶原支架,3组为SVFs+胶原支架+VEGF-PLA缓释微球,2组和3组体外成脂诱导3天后进行裸鼠体内移植,三组移植同一只裸鼠皮下；分别于4w后取出新生标本,通过大体观察、测量湿重、HE染色观察新生组织结构和血管生长情况,高倍镜下计数新生毛细血管密度,收集数据并进行统计学比较分析。统计学处理所得数据均采用SPSS16.0软件包进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示。P0.05差异有统计学差异。SVFs培养贴壁生长曲线(OD值)采用曲线拟合方法分析。DiI标记对细胞增殖能力影响采用重复测量的方差分析。DiI标记后对SVFs培养所得未传代P0代细胞成脂能力影响采用独立样本T检验。透射电镜和圆二色谱法测缓释微球直径的比较采用独立样本T检验。体内脂肪移植物湿重比较采用单因素方差分析。体内脂肪移植物血管数比较采用单因素方差分析。组织工程新生物湿重比较采用单因素方差分析。组织工程新生物血管数比较比较采用单因素方差分析。结果 1.从抽脂术患者得到的脂肪组织当中成功分离得到SVFs,贴壁生长后形态类似于成纤维细胞,具有很强的分裂增殖能力,3至7天时细胞增殖快速。对所测的OD值进行曲线拟合方法分析,用Quadratic模型,R2=0.965,回归方程检验有统计学意义(F=503.047,P=0.000)。用成脂、成骨、成软骨定向分化诱导液诱导2～3周后,分别用油红O、茜素红、阿新蓝染色呈阳性反应。 2.体外用DiI成功标记SVFs,标记后细胞呈现较强的红色荧光,标记率较高,标记后细胞成活率较高,达(92.31±1.52)%。与正常的SVFs成活率(92.73±0.57)%并无差异。两组进行独立样本T检验。经方差齐性分析,两组样本的方差不齐(F=5.396,P=0.043)。两个样本之间的均值差异无统计学意义(t=-0.631,P=0.550),DiI标记对SVF细胞成活率无影响。对OD值进行重复测量分析。Mauchly's Test of sphericity检验Mauchly'sW为0.001,P=0.018,7次测量的OD值存在相关性。Test of within subjects Effects(Greenhouse-Geisser校正)见时间因素P=0.000。时间和分组作用P=0.524,F=0.693。可见时间因素的作用有统计学意义,测量指标有随时间变化而变化的趋势,而时间因素的作用不受分组因素影响。Test of Between-Subjects Effects分组作用的F=0.062,P=0.810,可见分组因素不起作用,两组无区别。每个检测点DiI标记组和未标记组OD值差异无统计学意义(每个点P0.05详见表2-2)。重复测量分析两组OD均数变化趋势,2组几乎重叠(详见图2-3)以上的分析结果可见DiI标记对SVFs贴壁培养的PO代细胞增值能力无影响。DiI标记后对SVFs培养所得未传代P0代细胞成脂能力也没有太大的影响,两组进行独立样本T检验。经方差齐性分析,两组样本的方差齐(F=0.794,P=0.399)。两个样本之间的均值差异无统计学意义(t＝1.562,P=0.157),DiI标记对SVF细胞成活率无影响。 3.体外成功构建VEGF-PLA缓释微球,微球表面光滑、球体大小均匀、形态饱满；微球直径平均为(27.56±4.60)nm；微球样品包封率为(89.24±1.24)%,计算样品的载药量为：{(17.85±0.25)×10-3}%；通过ELISA方法检测微球缓释特性,21d内微球可缓慢释放VEGF,第21d累计释药率为80.35%。将微球稀释后在透射电镜下测量其直径为(28.30±4.64)nm。与利用圆二色谱法测量微球直径法比较。两组进行独立样本T检验。经方差齐性分析,两组样本的方差齐(F=0.033,P=0.860)。两个样本之间的均值差异无统计学意义(t=0.253,P=0.253),两种测量方法无差异。 4.将3组混合物移植裸鼠体内8w后,裸鼠全部成活,移植物清晰可见。1组、2组和3组平均湿重分别为：(0.077±0.119)g；(0.159±0.016)g；(0.182±0.120)g。3组数据方差齐性检验,P=0.946,方差具有齐性。3组数据有显著性差异,3组间比较,F=167.678,P=0.000,3组数据差异具有统计学意义。第3组湿重高于第2组(P=0.001)。第2组湿重高于第1组(P=0.000)组织切片HE染色显示第3组脂肪细胞成活率最高,纤维性成分最少,第2组次之,第1组内部纤维性成分最多；免疫组化结果同样是第3组表达最强,第2组次之,第1组最少。血管密度计数经统计学比较分析,第1、2、3组平均新生血管数量分别为：(7.25±1.83)个/HP;(12.65±1.69)个/HP；(14.75±2.02)个/HP；3组数据方差齐性检验,Levene statistic为0.256,P=0.775,方差具有齐性。组间比较,F=87.048,P=0.000,3组数据有显著性差异。第3组血管数多于第2组(P=0.000)。第2组血管数多于第1组(P=0.001)。 5.三组移植物移植裸鼠体内4w后,动物全部成活,第2组和第3组成功构建出脂肪组织。新生物湿重测定,术后4w时三组湿重分别为：(23.28±3.86)mg,(31.16±2.19)mg,(36.67±1.60)mg,运用SPSS软件进行单因素方差分析,首先进行方差齐性检验,Levene statistic为3.044,P=0.069,方差具有齐性。三组湿重比较,差异具有显著性(F=48.768,P=0.000)。1组比2组轻,差异具有显著性(P=0.000)。2组比3组轻,差异具有显著性(P=0.001)。4w时第1组、2组和3组新生毛细血管密度平均分别为(1.81±0.83)个/HP,(2.62±0.89)个／HP,(3.44±1.09)个/HP。Levene statistic检验,方差具有齐性(P=0.318)。Levene statistic为1.177,方差具有齐性(P=0.318)。三组比较F=11.846,差异具有显著性(P=0.000)。1组比2组血管少,差异具有统计学意义(P=0.019)。2组比3组血管少,差异具有统计学意义(P=0.019)。可见VEGF-PLA缓释微球联合SVFs能够明显促进胶原支架体内成脂和血管化水平。结论 1.抽脂术获得的脂肪组织能够成功分离提取大量的多能干细胞,经形态学、及多向分化鉴定证实为干细胞成分。该细胞容易获取、来源丰富、在相应的诱导条件下能够分化成为目的细胞,可作为脂肪组织工程理想的种子细胞。 2.DiI标记是一种较好的细胞示踪方式,标记后细胞成活率较高,不会影响SVFs培养所得未传代P0代细胞的增殖和成脂分化的能力。 3.将VEGF包被于PLA微球中,可以使微球中VEGF缓慢释放进入局部微环境,从而达到VEGF对周围细胞持续发挥作用的目的。 4. SVFs和VEGF-PLA缓释微球体内能够明显促进脂肪颗粒的成活率,同样能够明显促进脂肪颗粒移植血管化的水平,是一种辅助脂肪颗粒移植理想的种子细胞和细胞因子缓释剂。 5.VEGF-PLA缓释微球联合SVFs体内能够明显促进新生组织的血管化,与胶原支架混合移植能够构建出成熟的脂肪组织。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.1

【参考文献】