新型纳米生物螺钉及生物股骨髁的制备与相关实验研究

发布时间：2018-11-09 15:50

【摘要】：第一部分纳米羟基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纤维材料的制备及其对成骨细胞生物学行为的影响目的研究纳米羟基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纤维（nano-hydroxyapatite/polyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）复合材料的细胞相容性及其对MC3T3-E成骨细胞生物学行为的影响，为后期应用提供实验依据。方法制备圆片状n-HA/PA66/GF材料并按照ISO10993标准制备其浸提液。取MC3T3-E1成骨细胞，分别与圆片状材料或其浸提液共培养。通过直接接触实验、扫描电镜观察及CCK-8法检测该材料对成骨细胞黏附、生长、增殖的影响；通过BCA法检测材料对成骨细胞总蛋白合成的影响；通过酶联免疫吸附测定法检测材料对成骨细胞骨钙素分泌的影响；通过流式细胞术检测材料浸提液对成骨细胞周期的影响；通过AnnexinV-FITC/PI双标记法检测材料对细胞凋亡的影响；通过Transwell小室迁移实验检测材料对成骨细胞迁移的影响；通过双标记间接细胞免疫荧光染色在激光共聚焦仪上观察材料及其不同浓度的浸提液对细胞骨架及肌动蛋白纤维分布的影响。结果直接接触实验表明n-HA/PA66/GF材料对MC3T3-E1细胞无明显细胞毒性。材料周围的细胞生长旺盛,为长梭形，无空泡及细胞皱缩，贴壁生长良好。CCK-8实验显示细胞数量随着培养时间延长而增多,实验组与两对照组之间的差异在共培养前5天无统计学意义（p0.05），在培养7天后实验组细胞数量较阴性和阳性对照组多（p0.05）。实验组与对照组细胞总蛋白含量分别为（2.21±0.48）mg/ml、（1.68±0.25）mg/ml, BCA法检测证实材料能促进成骨细胞总蛋白的合成，两组之间差异有统计学意义（p0.05）。流式细胞检测结果证实材料能使更多细胞进入S期而对细胞凋亡率无明显影响。两组细胞的凋亡率分别为7.93%±2.37%、8.31%±2.84%,差异无统计学意义（p0.05）。Elisa检测的两组细胞分泌的骨钙素含量在共培养1、3、5、7天时差异无统计学意义（p0.05），但在共培养10、14天后材料能促进成骨细胞分泌骨钙素（p0.05）。Transwell迁移实验显示穿膜细胞数两组之间无统计学差异（p0.05）。扫描电镜观察见材料表面的成骨细胞形态规整呈长梭形，细胞之间紧密相连并通过伪足紧紧黏附在材料表面，随着培养时间延长逐渐呈现复层生长。免疫荧光结果表明不同浓度的材料浸提液对细胞骨架及肌动蛋白纤维的极性分布无明显影响，n-HA/PA66/GF材料具有良好的细胞相容性，能为细胞的粘附与增殖提供适宜的环境。结论新型n-HA/PA66/GF复合材料具有良好的成骨细胞相容性，对细胞生长、增殖、分泌、黏附、周期和迁移等行为均有一定调节作用。第二部分纳米羟基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纤维生物活性螺钉固定犬股骨髁间骨折的实验研究目的评估纳米羟基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纤维（nano-hydroxyapatite/polyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）生物螺钉的体内生物相容性、内固定性能及骨传导性能，为后期临床推广应用提供实验依据。方法通过注塑成型方法制备n-HA/PA66/GF生物活性螺钉。使用扫描电镜观察、能谱分析、X射线衍射分析及红外图谱分析对材料进行表征。取24只成年中华田园犬，随机分为两组：生物螺钉实验组和金属螺钉对照组。所有动物均造股骨髁间骨折，分别使用生物螺钉及金属螺钉固定骨折。于术后4、8、12、24周行大体观察、硬组织学切片染色检测、CT+3D影像学检测、三点弯曲生物力学测试及血常规、生化检测，术后24周处死动物后取肝脏、肾脏、脾脏行组织学检测。结果扫描电镜观察显示涂层在螺钉表面分布均匀，涂层与基体材料之间无相分离，结合紧密，融合为一体。涂层粒子为纳米级别，呈片状或叶状。EDS能谱分析结果显示涂层的主要成分为Ca和P元素，表明涂层组成为n-HA。X射线衍射（XRD）分析显示2θ=31.82°，32.90°,34.25°,38.38°,46.70°,49.52°和53.15°属于羟基磷灰石的晶格特征峰，2θ=20.38°，23.49°为聚酰胺（PA）晶格的主峰。红外图谱分析（FTIR）发现3442cm-1处宽而强的吸收峰为对应羟基（-OH）振动吸收峰，960cm-1处的吸收峰对应PO3-4对称伸缩振动吸收峰，605cm-1和565cm-1吸收峰对应PO3-4的弯曲振动，1102cm-1和1037cm-1处的吸收峰对应PO3-4的非对称伸缩振动吸收峰。动物实验证实两种螺钉均能有效地固定犬髁间骨折,术后观察两组动物均正常活动，切口愈合良好。术后12周CT检测显示两组动物髁间骨折均已骨性愈合。组织学检测发现n-HA/PA66/GF螺钉表面被新生骨覆盖且新生骨不断钙化、成熟，骨与生物螺钉结合紧密。金属螺钉与骨之间存在较大间隙，螺钉周围骨组织被一层纤维组织包裹。Micro-CT检测结果显示使用两种螺钉固定骨折12周后均发生骨性愈合。生物螺钉周围较金属螺钉周围有更多的新生骨小梁形成，生物螺钉与周围的新生骨融为一体。生物力学测试证实两组最大推出载荷在术后4、8、12周无统计学差异（p㧐0.05），但在术后24周有统计学差异（p0.05），推出生物螺钉所需的最大载荷比对照组大。术后24周实验动物静脉血中碱性磷酸酶水平升高[(58.8±14.49)U/L]，检测的血常规、生化各数值均正常。肝、脾、肾HE染色未见结构正常，表明材料无明显的器官毒性。结论 n-HA/PA66/GF生物活性螺钉具有良好的体内相容性,内固定性能和促进新骨形成、成熟性能，具有广阔的应用前景。第三部分聚氨酯/纳米羟基磷灰石/聚酰胺66修复犬股骨髁缺损的实验研究目的评估复合材料聚氨酯/纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(polyurethane/nano-hydroxyapatite/Polyamid66, PU/n-HA/PA66）修复犬股骨髁缺损的能力。方法制备PU/n-HA/PA66复合材料并按照犬股骨髁实际大小加工成型为生物股骨髁。扫描电镜观察材料表面情况并测定其孔隙率。取16只成年中华田园犬，按随机数字表分为两组：PU/n-HA/PA66生物股骨髁实验组和自体股骨髁对照组。使用电锯将犬股骨外髁锯断造股骨髁缺损模型,分别使用生物股骨髁及自体股骨髁修复缺损。术后4、8、12、24周行大体观察、组织学检测、免疫组化染色、CT影像学检测及血常规、生化检测，术后24周行肝、肾、脾组织学检测。结果经测定，材料孔隙率为80.89%±5.01%。孔径主要分布在300μm～800μm之间，孔壁上有与相邻孔贯通的100μm～300μm微孔。术后2组动物均活动正常，切口愈合良好。CT影像见实验动物的PU/n-HA/PA66股骨髁与自体股骨内髁紧密键合,材料无降解，假体与胫骨平台、股骨内髁及髌骨的关节面匹配良好，内外侧膝关节间隙无狭窄且基本对称。组织学检测显示两组股骨髁假体均与自体骨结合紧密，生物股骨髁网孔中的骨小梁逐渐增多成熟。免疫组化染色显示材料孔穴中的新生骨Ⅰ型胶原阳性表达，被染成棕黄色，染色均匀。术后测得犬静脉血中碱性磷酸酶水平升高[(62.67±24.04)U/L]，，其余血常规、血生化均正常。肝、脾、肾HE染色未见异常。结论 PU/n-HA/PA66股骨髁生物相容性良好，能与宿主骨形成有机整体，在骨缺损修复的同时重建残缺的股骨髁，具有临床应用前景。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

【参考文献】