【摘要】：在低温医学的研究和临床应用中,亚低温的脑保护作用得到了广泛的公认和长足的发展,尤其是在特重型颅脑损伤(severe craniocerebral injury)的救治方面,亚低温通过降低脑组织代谢率、抑制钙超载、减轻自由基蓄积、稳定线粒体膜功能等方面发挥脑保护作用。随着研究的逐渐深入,发现亚低温治疗虽然能有效降低重型颅脑损伤的死亡率,但仍然有约25%左右的急性期死亡率。于是有关深低温的研究变提上议事日程。深低温停循环(deep hypothermic circulation arrest, DHCA)的研究和临床应用始于上世纪的50年代,20年之后,DHCA技术广泛使用于复杂先心病、主动脉弓及胸主动脉等大血管手术中,能发挥有效的神经功能保护作用,随着研究的深入和停循环时间的延长,DHCA又可引起近期和远期严重并发症,而DHCA结合间断性脑低流量灌注或顺行性脑灌注/逆行性脑灌注能显著降低单独使用DHCA时并发症的发生率,因此该技术的临床应用收到一定的限制。那么究竟DHCA的损伤或者保护作用是通过哪些蛋白质实现的呢,如何才能有效放大其保护作用而降低并发症的发生呢?众所周知,蛋白质是生物体功能的执行单位,不同的功能状态一定伴随着蛋白质的变化或者蛋白质空间结构的转变,而差异蛋白质组学正是在此基础上得以产生和发展。蛋白质组学始于1994年,在基因组学研究逐渐完成之后迅速兴起的生命科学研究的热点。经典的方法是双向凝胶电泳(2D-PAGE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF-MS),该方法的优点是技术成熟稳定,对实验室的条件要求相对较低,缺点是对于低丰度蛋白质、相对分子量200KD和相对分子量8KD极小蛋白质、极碱性蛋白和疏水性蛋白等都难以进行有效分离。在2004年美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI)推出相对和绝对定量核素标记(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, i-TRAQ)技术,该技术与液相色谱-串联质谱(Liquid Chromatography-Mass Separation/Mass Spectra Characterization, LC-MS/MS,也称液相色谱-二维质谱)结合,形成新的蛋白质组学方法。该方法可对复杂标本如细胞器、细胞裂解液等样本进行研究,具有较好的定量效果和较高的重复性,同时可以对双向电泳无法处理的低丰度蛋白及特殊性质蛋白质的鉴定。目前在神经系统疾病的研究主要集中于癫痫、Parkin's病及精神障碍等功能性疾病的差异蛋白质筛查。在神经系统蛋白质组学研究方面,多数为利用双向凝胶电泳技术对胶质瘤、颅脑损伤、功能性神经外科疾病及蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛等的研究。在缺血缺氧性脑损伤研究方面,有采用2-DE的方法研究大鼠海马组织在慢性脑缺血后的差异蛋白质表达。线粒体是细胞能量的转换器,是细胞的能量工厂,三羧酸循环、电子传递链及氧化磷酸化均在线粒体内进行。线粒体在整合各种信号刺激、决定细胞命运的过程中起着枢纽的作用,即最终形成诱导细胞凋亡或者死亡的结果。目前认为线粒体是缺血性损害亚细胞结构的靶目标,其中细胞坏死是一个不可逆的过程,而细胞凋亡是可逆的过程,因此通过多种机制保护线粒体功能为缺血缺氧性脑病治疗提供思路。在脑缺血时线粒体蛋白自身表达的差异可能是线粒体在凋亡过程中起决定作用的物质基础,研究这些差异蛋白,对阐述疾病机制、选择药物作用的靶点,对缺血性神经元损伤的防治有着重要意义。课题组建立了猴脑选择性深低温停循环模型,实现了脑循环和体循环的相对分离,将脑温控制在深低温(16℃)水平时可以实现中心体温在33℃以上。猴脑极限缺血实验结果显示：脑血流阻断同时或者10min后开始深低温脑灌注组猴全部存活、无任何脑神经功能障碍,MRI和病理显示脑组织未见异常；脑血流阻断20分钟后开始深低温脑灌注组猴则全部死亡,进一步验证了深低温的脑保护作用,同时表明脑组织缺血缺氧的极限时间是10分钟。在此基础上,我们设计了本实验。本研究共分为四个部分,第一部分为大鼠深低温停循环动物模型的建立和免疫组化的验证,模型主要部分采用了2006年我科研究生所用之相对成熟的模型,穿刺动脉由腹股沟动脉改为尾动脉；第二部分为海马组织线粒体的提取纯化和验证(分别按照形态学验证和标记蛋白的Western-Blot验证),采用梯度离心的方法；第三部分对线粒体蛋白质标本利用i-TRAQ结合LC-MS/MS技术获取肽段信息,Mascot 2.2软件查库鉴定和分析获取蛋白质,最后经统计分析获得差异蛋白质,该部分内容在中科院上海生命科学院蛋白质组学研究实验室完成；第四部分按照同样的方法完成动物模型,获取海马组织并冰冻超薄切片后,对所获取的COX蛋白、单酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶联受体三个差异蛋白质进行定性和半定量的逆向验证(免疫组化荧光双染色和Western-Blot)。第一部分大鼠深低温停循环模型的建立及免疫组化验证目的：通过插管的方法建立大鼠闭胸式体外循环模型,同时通过检测额顶叶皮质信号转导分子2 (Smad2)和低氧诱导因子(HIF-1)的表达间接判断模型的稳定性；方法：切开右侧颈部和尾部皮肤,暴露颈内静脉和尾动脉,以带侧孔的16G导管和22G留置针分别穿刺颈内静脉和尾动脉,通过蠕动泵、大鼠用氧合器及变温水箱等建立大鼠体外循环模型,手术中依氧饱和度调整灌注速度。分别完成常温不停循环10min (33℃)、常温停循环10min (33℃)和深低温停循环10min (27℃)三组动物模型,快速断头取大鼠额顶叶皮质,制作石蜡切片,应用HE染色和免疫组化法从蛋白质水平研究Smad2和HIF-1α在缺血早期大鼠大脑皮层的表达情况。结果采用SPSS软件进行统计学分析；结果：模型建立过程中,在深低温组实现目标中心体温(27℃)的平均时间为10min,停循环10min后取皮质和海马并置于液氮中保存,另外两组模型均顺利完成。Smad2在DHCA组、NTCA组和NC组表达均有统计学意义(P0.05)：且Smad2表达呈现出逐渐减少的趋势；HIF-1α在DHCA组、NTCA组和NC组表达有统计学意义(P0.05),且HIF-1α表达同样呈现出逐渐减少的趋势；结论：通过插管的方法可以完成大鼠闭胸式体外循环,模型重复性良好。Smad2和HIF-1α在三组动物模型额叶皮质的表达有差异(P0.05)第二部分大鼠海马线粒体的纯化及电镜和WeStern-Blot的验证目的： 提取大鼠海马组织线粒体并且纯化,同时对所获取线粒体形态和特异性等进行验证；方法：利用梯度离心的方法进行线粒体的纯化：海马组织在冰面上碎化匀浆,加入相应的蛋白酶抑制剂及其它试剂,多次不同速度离心、沉淀、再离心、再沉淀,最后去上清,洗脱线粒体沉淀,取0.1g加入1ml 4%多聚甲醛固定,送透射电镜检测；取30ug样品行Western-blot检测,经电泳、转膜和封闭后,加Cox-Ⅳ抗体和二抗,染色后曝光；结果： 电镜照片显示线粒体提取纯度较高,线粒体结构完整,内外膜清晰,内部基质均匀。Western-blot结果显示目标蛋白质分子量在17KD位置,与Cox-Ⅳ理论分子量相符；结论：采用美国Thermo公司线粒体纯化试剂盒能获得纯度较高的线粒体,同时线粒体超微结构和特异性标记蛋白质均可得到很好的保留,适合进一步研究。第三部分基于i-TRAQ技术的大鼠海马线粒体蛋白质组学研究目的：筛查常温不停循环、常温停循环、深低温停循环时大鼠海马线粒体的差异蛋白质,为进一步深入研究DHCA脑保护机制提供线粒体靶蛋白。方法： 海马线粒体蛋白质标本首先行SDS-PAGE电泳初步判断合格后,经蛋白酶解和肽段定量后,各组按照核素标记相对和绝对定量技术的要求进行体外肽段标记,经毛细管高效液相色谱分级后进行质谱鉴定,获取肽段信息,Mascot 2.2软件查库鉴定和分析获取蛋白质,统计分析获得差异蛋白质。结果：本实验共获得差异蛋白质29个(在两次重复实验中同时满足表达量1.5倍以上或者0.66倍以下且P0.05),包括腱糖蛋白C、纤溶酶原、假想蛋白loc365985、嘌呤合成双功能蛋白、囊泡分拣蛋白45、G蛋白偶联受体37、接触偶联蛋白1、无活性的磷脂酶C、猫眼综合症染色体蛋白、钠氯依赖GABA转运蛋、短蛋白聚糖核心蛋白异形体、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、单酰基甘油脂肪酶、钠氯依赖GABA转运蛋白-1、络蛋白激酶2亚单位、半胱氨酸-谷氨酸富含蛋白-1、细胞色素C氧化酶线粒体亚单位7A2、血红蛋白亚单位、血红蛋白b-l球蛋白、肿胀性成虫盘长亚型和NIT 2蛋白末尾的酰胺酶等21个已知蛋白质,另外8个为未知蛋白质。结论：深低温停循环技术的脑保护作用与海马线粒体的部分蛋白质的差异表达有关。第四部分差异蛋白质的验证目的通过免疫荧光和Western-Blot方法对已获取的COX7A2、单酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶联受体37等部分差异蛋白质进行定性和半定量的逆向验证；方法取大鼠40只,按照前述相同步骤和分组建立动物模型,获取大鼠海马组织,冰冻超薄切片后按照免疫荧光双染色的步骤染色确定性质,选取COX7A2、单酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶联受体37三种差异蛋白质,同时利用Western-Blot对相应蛋白质进行含量的半定量检测；结果线粒体COX7A2、单酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶联受体37三种蛋白定性准确,免疫荧光反应提示目标蛋白质在DHCA组位于胞质内,而在其它组则可见较明显的胞质外染色,如大量重叠染色出现在细胞核内,说明目标蛋白质已经从胞浆线粒体内释放至线粒体外。半定量结果提示各组蛋白质总表达量变化不明显(P0.05)。结论深低温停循环可抑制或者减轻线粒体COX7A2、单酰基甘油脂肪酶和G蛋白偶联受体37等蛋白质在急性缺血缺氧条件下由线粒体向线粒体外胞质的释放,由此推断DHCA抑制或者减轻C0X蛋白等线粒体蛋白质由线粒体内向线粒体外胞质的释放是其在线粒体层面发挥脑保护作用的主要机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.52
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 刘英芹,王继红,唐文渊;低氧诱导因子-1与缺血性脑血管病[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2004年05期
2 徐蔚,高永军,孙亮,冯忠堂,付登礼,唐一平;猴脑选择性深低温对全身主要器官功能的影响[J];昆明医学院学报;2003年02期
3 谢秀枝;王欣;刘丽华;董世雷;皮雄娥;刘伟;;iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年07期
4 夏恒传;张春霞;冯凡;袁弋;周阳;刘晓勇;朱克明;姚勤;陈克平;;多囊体生物发生和蛋白质分拣——ESCRT、Vps4、Ubiquitination一个都不能少[J];生物化学与生物物理进展;2013年02期
5 杨朋范,朱诚,江基尧,卢亦成,张光霁,于明琨,卢洪流,袁国梁,蔡如钰,包映晖;犬颈内动脉内冷灌注脑选择性降温对脑保护的实验研究[J];中华创伤杂志;1999年03期
6 苏殿三,王祥瑞,郑拥军,赵延华,张挺杰;不同程度血液稀释对深低温停循环大鼠脑损伤及氨基酸含量的影响[J];中华麻醉学杂志;2005年04期
7 梅广海;秦华平;贾锋;包映晖;高国一;梁玉敏;江基尧;;深低温脑保护的差异蛋白质组学研究[J];中华神经外科杂志;2006年11期
8 Bao-Nan Liu;Bo-Xiang Han;Feng Liu;;Neuroprotective effect of pAkt and HIF-1α on ischemia rats[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2014年03期
9 朱京童;张欔;郑海洲;郑智慧;路新华;董爱华;段宝玲;;人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究[J];中国抗生素杂志;2012年08期
10 张壮;魏尔清;卢韵碧;;GPR17在中枢神经系统损伤修复中的作用研究进展[J];浙江大学学报(医学版);2013年03期
相关博士学位论文 前1条
1 王小华;深低温停循环脑损伤及脑保护的机制及应用研究[D];北京协和医学院;2012年
相关硕士学位论文 前3条
1 魏亮;深低温停循环对鼠大脑皮层HIF-1α和凋亡相关基因表达的影响[D];昆明医学院;2006年
2 廉坤;深低温停循环对大鼠大脑皮层Smad2和Smad4表达影响的实验研究[D];昆明医学院;2010年
3 赵辉;线粒体脑肌病一个家系的临床、病理和分子病理研究[D];山东大学;2013年
，
本文编号：
2349808
