【摘要】：目的： 目前,利用组织工程技术增强骨再生已经成为骨缺损治疗研究的热点。虽然将生长因子结合于材料的方法在诱导组织再生方面取得了进展,但普遍存在着生长因子释放难控制、易失活、成本高昂等缺点。基因治疗技术的发展为解决这些问题提供了新的选择。将具有转染能力的基因载体结合于组织工程支架材料以构建基因活性基质成为一种新的策略。在体内外释放、转染和表达所编码的生长因子。本文在研究PAMAM树状分子/rhBMP-2质粒复合物体外转染的基础上,将此复合物负载于TCP/I型胶原支架以构建基因活性基质(GAM)。检测这一基因信号体系的生物相容性和转染能力,观察其诱导干细胞分化的效果,进而将其应用于骨缺损的动物模型,观察体内促骨修复结果。探讨这一材料体内外诱导成骨作用。通过本研究,以期为今后应用这一新的治疗手段提供实验基础。 方法： 1、选取体重小于120g,5-7周的年轻雄性SD大鼠。断颈椎处死后消毒提取胫骨和股骨骨髓,采用贴壁分离培养法分离血细胞和原代rMSC.对第三代rMSC使用脂肪诱导培养液和矿化诱导培养液进行脂肪向及成骨向诱导2至3周,观察细胞形态并分别进行苏丹Ⅲ染色和茜素红染色。流式细胞仪检测所培养第三代细胞表面CD29、CD90、CD14、CD31、CD34和CD45的表达率。 2、将G5dPAMAM和DNA质粒按照质量比4：1的比例混合反应,制备G5dPAMAM/DNA质粒复合微粒。MTT法鉴定不同浓度的复合物对rMSC和COS-7细胞增殖的影响,探讨无明显毒性下的合理转染浓度。体外对COS-7细胞转染实验,荧光显微镜观察其转染效果。 3、1型胶原的碱性溶液中加入纳米β-TCP粉末溶解,冷冻干燥法制备β-TCP/I型胶原复合多孔支架。将第二章中所制备的dPAMAM-DNA质粒复合物滴加于支架,顺序降温反应并冰冻以构建GAM. MTT (?)去测定rMSC在不同质粒负载量的GAM中增殖速率,筛选出最佳的质粒复合物负载量。比重法测定两种材料的孔隙率,扫描电镜观察其微观结构,Picogreen测定质粒复合物释放速率。分别接种rMSC于两种材料上并连续培养5天。扫描电镜观察材料表面细胞生长情况。对GAM内的rMSC荧光染色,激光共聚焦显微镜扫描观察材料内部细胞贴壁、生长及分布。 4、根据上一步方法制备含GFP质粒的GAM,与rMSC在含血清环境中共培养3天后取出GAM. DAPI染色细胞核,荧光显微镜观察GFP表达率并计算转染效率。制备含rhBMP-2质粒的GAM,接种rMSC并在含血清环境中连续体外培养25天。定时提取GAM-rMSC共培养物的上清液,ELISA法测定rhBMP-2浓度,ALP试剂盒测定培养液中ALP水平变化。探讨新建GAM在血清环境中促成骨应用的可行性。 5、取45只成年SD大鼠,全麻下于右侧股骨中段制备5mm长的全段缺损。分为3组,分别设定植入GAM、纳米β-TCP/I型胶原复合支架和空白无植入物组,髓内钉固定。连续12周观察其存活和术区愈合情况,定期进行X线检测；定期提取血清测定rhBMP-2、ALP水平；断颈椎处死动物,取术区标本制备切片,HE染色观察成骨,免疫组化染色检测术区rhBMP-2表达。 结果： 1、所分离提取的细胞呈典型贴壁生长。在成骨向诱导2周后,光镜下可见白色高折光率的矿化微粒,茜素红染色阳性。脂肪向诱导3周后,光镜下见细胞增大,内含圆形脂滴,苏丹Ⅲ染色阳性。流式细胞术检测示细胞表面CD90和CD29表达率高达98%和97%,CD14、CD31、CD34和CD45低表达。 2、G5dPAMAM/DNA质粒复合微粒具有良好的生物相容性,在较低浓度即对COS-7细胞表现出良好的转染能力,高浓度下不利于COS-7细胞增殖。此复合物在含血清的体外环境中能够有效转染COS-7细胞,且转染效果具有一定的时间累积效应。 3、所制备的GAM具有多孔结构,孔径大,孔隙率高。在2周内能够持续释放DNA质粒复合物,第6天的释放量达到高峰。MTT显示细胞在GAM内增殖速度快。MSC在GAM中贴壁良好,细胞形态正常。激光共聚焦显示rMSC在GAM的各个深度均匀浸润分布,呈三维立体生长。 4、GAM在体外环境中可有效转染rMSC,所转染细胞经过连续培养,能够在10天内表达并分泌所编码的rhBMP-2。通过25天的ALP检测发现,GAM组培养液中的ALP活性水平高于对照组和空白组,提示rMSC成骨向分化活性增强。 5、45只大鼠术后全部存活,创口愈合良好,未见明显炎症感染。X线结果示GAM组于12周内完成股骨连续性的修复,纳米β-TCP/I型胶原复合支架和空白组均未能完成修复；ELISA检测显示GAM组动物血清的rhBMP-2浓度明显高于其他2组,ALP水平在早期达到高峰；HE结果显示GAM组的缺损区较其他2组有更快的骨化过程,免疫组化显示在2至4周内GAM组能于骨断段边缘新生骨区表达rhBMP-2. 结论： 1、贴壁分离培养法从大鼠胫骨和股骨所提取的细胞具有良好的多向分化潜能,经诱导可分化为骨细胞。流式细胞术显示所培养细胞高表达MSC的标志抗原,确认为rMSC。此细胞适用于骨组织工程研究。 2、G5dPAMAM/DNA质粒复合物在转染浓度下具有良好的生物相容性和体外转染能力,适合用于基因治疗研究。这种复合物的转染过程可在含血清环境中进行。 3、纳米β-TCP/I型胶原复合支架和在此基础上构建的GAM呈疏松多孔隙结构,孔隙率均大于90%,具有良好的生物相容性,适于rMSC生长。GAM在体外培养中能够持续释放DNA质粒复合物。 4、新建的GAM能够在体外血清环境的培养中释放编码rhBMP-2的质粒复合物且转染rMSC。受转染的细胞能表达并分泌rhBMP-2,对rMSC的成骨向分化具有诱导作用。 5、GAM的植入能够加速股骨截断性缺损的修复重建,使缺损的股骨在12周内完成结构上的连续性修复。所编码的rhBMP-2可在术后4周内有效表达。这种基因缓释体系具有良好的体内应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.08
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