组织界面刚度变化对骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响

发布时间：2018-12-13 20:49

【摘要】：研究背景间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能(Multiple differentiation potentiality)的细胞。作为成体干细胞中最重要的一种,能够向成骨、软骨、肌细胞,以及神经、脂肪细胞等方向分化,MSCs优良的多向分化能力决定了其成为组织工程中重要的种子细胞来源。最新研究显示,MSCs在骨损伤、脊髓损伤等组织修复和再生工程中均发挥重要作用。但针对细胞周围微环境和支架材料的之间的作用关系,尤其是接触界面刚度力学特性等调控MSCs生长、定向分化作用机理的相关研究并不完善。影响MSCs分化的因素中,除了生物化学等作用条件外,还包括传导力学信号的生物物理因素。而利用仿生学原理从物理角度模拟特定的细胞微环境,实现细胞修复、损伤组织快速更新,是近年组织工程学中的一个热点。研究目的细胞接触的界面其物理力学特性可对BMSCs的铺展、迁移、增殖以及分化产生一定程度的作用。本文着重研究界面刚度对MSCs增殖及成骨分化的影响,通过选取一定范围的刚度数值,制备刚度不同的聚丙烯酰胺水凝胶,表面修饰后获得最大化仿生组织细胞外基质的界面。继而在界面上培养BMSCs并观察其铺展生长状态,检测其成骨分化相关指标和关键信号通路蛋白的表达差异,探讨组织界面刚度变化对BMSCs生长、成骨分化的影响。以期从分子生物学角度验证刚度作为一个独立因素的成骨诱导能力,为后续深入研究干细胞对刚度的响应机制、刚度调控细胞分化的分子机理打下基础。研究方法1. BMSCs细胞培养体系无菌条件下,取4周龄SD大鼠的后肢长骨并以10%FBS、DF-12完全培养基冲洗骨髓腔,全骨髓细胞贴壁培养费联合差速消化法培养、传代后得到BMSCs。体外扩增培养。选取P1-P4代BMSCs染色观察形态结构；平板克隆实验观察P1、P2、P4代的BMSCs其自我更新能力,观察不同时间点位BMSCs的生长,进行细胞计数绘制生长曲线。利用小鼠抗大鼠单克隆抗体FITC-anti-Mouse/Rat CD 44、PE-anti-Mouse/Rat CD45、APC--anti-Mouse/RatCD90,分别通过免疫荧光技术、流式细胞术鉴定P2代BMSCs表面分子标志。2.不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶(PA胶)的制备及表面修饰处理对凝胶载体培养皿和盖玻片化学处理,通过改变Acrylamide、Bis-Acrylamide配比组份,获得不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶(PA胶),紫外线照射下,在胶面上化学交联Collagen I、Fibronectin联合涂被。蛋白修饰后的PA胶模拟组织界面刚度,仿生细胞外基质微环境,并具备实验需求的刚度数值。3.不同刚度PA胶界面上的细胞行为观察选择适宜的P2、P3代细胞,分别在不同刚度的PA胶界面上接种培养,种植密度为1000个/100μL,以10%FBS、 DF-12完全培养基。PA胶分按刚度梯度分组。刚度区间选择1-80Kpa,分为A组(4kpa)、B组(10kpa)、C组(40kpa)、D组(80kpa)、E组(1kpa)和普通培养皿对照组(极限刚度)进行双盲实验。倒置显微镜下观察不同时间点位各组细胞的形态、细胞铺展面积,对不同时间点位细胞计数并绘制BMSCs生长曲线。免疫荧光观察P3代BMSCs细胞骨架、骨桥蛋白和骨钙素。对蛋白修饰后的PA胶环境进行CCK8毒理学测试。4.不同刚度PA胶界面上的细胞成骨行为的观察选取A组(4kpa)、B组(10kpa)、C组(40kpa)作为低、中、高刚度对比,与普通培养皿对照组共4个分组同时接种P2代BMSCs,观察界面上BMSCs成骨分化能力。茜素红染色法检测细胞成骨分化钙沉积状况；试剂盒检测碱性磷酸酶ALP浓度。ELISA检测BGP(骨钙素)、PICP(C-端1型前胶原)两个成骨分化指标,间接了解I型胶原合成速率。荧光定量技术PCR(FQ-PCR)检测BGP、Runx2、Collal的mRNA在不同刚度培养体系中的水平。Western blot检测F-actin和E-cadherin蛋白表达水平。探讨刚度差异对BMSCs成骨分化的影响,优选适宜成骨分化的刚度区间。结果1.P1-P4代的BMSCs培养48h后细胞集落增大增多,总体细胞密度较前呈倍数增长,培养72h后细胞呈现典型的纺锤体样外观,较多的贴壁细胞相互靠近融合,放射状或旋涡状。生长曲线呈现S形,与Logistic生长曲线相符合。所有体外培养的BMSCs均有停滞期、快速增长期、平台期。P1、P2、P4代的BMSCs克隆形成路分别为10.4%,9.7%和8.2%。P2代BMSCs的荧光免疫检测显示：CD90、CD44呈阳性表达,CD45为阴性荧光着色,流式细胞术检测P2代BMSCs表面分子标志显示：CD45-PE、CD44-FITC、CD90-APC表达率分别为1.65%、94.1%和95.8%。符合间充质干细胞的典型生物学特征,培养体系中细胞显示了良好的生长增殖态势。2.不同刚度PA胶界面上P2代BMSCs生长曲线显示：接种密度为1000个/100μL的条件下,在低刚度的PA胶界面上(1Kpa), BMSCs的增殖生长较普通培养皿对照组受到抑制,高刚度的PA胶界面(40、80Kpa)对BMSCs的增殖较普通培养皿对照组有一点促进作用；密度为5×106/ml条件下,B(10Kpa)和C(40Kpa)两种不同刚度的界面上,BMSCs除第一个24h的缓慢生长期外,生长均较对照组和A (4Kpa)组快,差异均具有显著性。结合毒理性测试可知：一定刚度范围内,随着界面刚度数值的增加,BMSCs的生长增殖呈现更加良好的态势。光镜下细胞形态观察结果显示：随着界面刚度的提升,细胞铺展形态随之增大,低刚度界面(1Kpa)上的典型细胞铺展面积只有高刚度界面(80Kpa)上的约38.8%。不同刚度PA胶界面的培养体系中,BMSCs细胞骨架典型且随细胞纵向走行,普遍可见细胞骨桥蛋白和骨钙素阳性表达,显示了在仿生的凝胶体系中,生长的BMSCs均具有较好的成骨分化能力3.高中低刚度A组(4kpa)、B组(10kpa)、C组(40kpa)的PA胶界面上,接种密度为1000个/100μL条件下,BMSCs均有成骨分化的趋势。WB实验中随着刚度提升,钙粘蛋白E-cadherin表达升高,而肌动蛋白(actin)表达无明显差异,提示随着界面刚度的增加,细胞铺展、迁移相关的钙粘蛋白表达降低,高刚度可促进细胞粘附。低密度培养时,指标ALP和BGP的水平在高刚度上明显升高。标志基因ALP、Collα1和Runx2的mRNA水平在随着界面刚度的提升逐渐增强,与ELISA检测结果基本类似,提示在一定范围刚度内,刚度数值较大的界面可促进BMSCs向成骨细胞分化。结论1.使用全骨髓细胞贴壁培养联合差速消化法,可在短期内较稳定地获得生长状态良好、增殖能力强、纯度较高的SD大鼠BMSCs。2.通过改变Acrylamide和Bis-acrylamide的浓度配比,可获得0.1kPa～80 kPa的不同弹性刚度的界面,表面修饰蛋白Collagen I、Fibronectin后能较好的模拟细胞外基质环境,有利于细胞的粘附和铺展。3. BMSCs的铺展面积随着界面刚度的提升而增加,实验组中低刚度界面上BMSCs铺展面积只有高刚度界面上的约38.8%。在低刚度的PA胶界面上(1Kpa), BMSCs的增殖生长较普通培养皿受到抑制；高刚度的PA胶界面(40、80Kpa)对BMSCs的增殖有一定促进作用,细胞行为因所依附的界面刚度不同而存在较大差异。4.单纯的物理性质改变能够一定程度上诱导BMSCs成骨分化,本实验的4-80kpa刚度范围内,成骨分化程度越高随着界面刚度的提升而增加；而10-40kpa刚度区间对BMSCs成骨分化均有促进作用。刚度作为一个物理因素可能通过参与WNT/β-Catenin、MAPKs信号通路而调控BMSCs的成骨分化。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08

【参考文献】