镁及镁合金可溶性降解产物对血管平滑肌细胞表型的影响

发布时间：2018-12-16 11:59

【摘要】：正常生理状态下,血管平滑肌细胞(VSMC)为增殖低、合成低的收缩型表型。当血管微环境发生异常时(如动脉粥样硬化),收缩型VSMC向多种表型方向转变。血管支架的植入是治疗动脉粥样硬化主要方法之一,镁基金属材料因其优越的机械特性和生物安全性,成为新一代血管支架的代表材料。但是因镁的快速降解而导致降解产物的大量产生显著影响血管微环境、进而影口响血管组织细胞(尤其是VSMC)。以往关于镁降解产物对VSMC影响的研究多集中于对细胞活力、增殖及凋亡的考察,忽略了对其表型转变的作用。鉴于VSMC显著的可塑性及不同表型VSMC均不同程度上参与了动脉斑块的形成和发展的事实,本文以纯镁及AZ31镁合金的浸提液同收缩型血管平滑肌细胞进行共培养,从细胞及分子水平上考察了镁基金属可溶性降解产物对VSMC表型转变的影响、并对介导表型转变的可能机制进行了初步探索。首先,本文改进胶原酶、胰肽酶复合酶二步法消化、建立了一种大鼠的胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞的分离制备方法。该方法操作简捷易行、重复性好,所得细胞活力佳、纯度高,并且细胞的收缩表型特征显著。其次,取含20%FBS的DMEM-F12培养基对纯镁及AZ31镁合金分别进行一天和三天的浸提,获得四种浸提液。通过对材料进行SEM、极化曲线和EIS以及对浸提液进行离子含量及pH的测定,考察纯镁及AZ31镁合金在含20%FBS的DMEM-F12培养基中的腐蚀行为。结果发现纯镁的腐蚀速率大于AZ31镁合金;腐蚀过程中均产生了大量的可溶性Mg~(2+),AZ31镁合金腐蚀后pH值大于纯镁;但纯镁腐蚀呈层片状,时间越长,片层越光滑细腻,AZ31镁合金主要为点腐蚀,时间越长,腐蚀坑越大,越不均一。随后,取四种浸提液、按照不同稀释比例处理收缩型血管平滑肌细胞,考察细胞增殖、徖移和凋亡行为的改变。结果发现,纯镁浸提液所可显著促进共培养的血管平滑肌细胞的的生长,细胞的增殖、迁移均增强,而凋亡被抑制;浸提时间、浸提液所占比例与这些细胞的这些反应呈正相关。AZ31的浸提液轻微的抑制了血管平滑肌细胞的增殖与迁移。进一步采用ICC、QRT-PCR、WB分析手段,考察浸提液对共培养的收缩型VSMC的基因表型的影响。结果表明,两种材料的浸提液处理后,细胞中Myh11、a-SMA、Smtn、Sm22a等收缩型VSMC的表型基因的表达水平均明显下降,且下降幅度依赖浸提时间和浸提液比例的变化,表明镁基金属材料的可溶性降解物削弱血管平滑肌细胞维持收缩型性状的能力;反之,一系列炎性细胞的表型基因(包括表面黏附分子Vcam1和炎性细胞因子ILIB、趋化因子Ccl2、Ccl20)的表达水平整体上调,表明经过浸提液处理后血管平滑肌细胞炎性表型特征明显增强。比较两种镁基金属材料浸提液后,本文采用MgSO4配制的(2.5、5、25、50)mmol/L含20%FBS的DMEM-F12培养基处理收缩型表型的血管平滑肌细胞,考察Mg~(2+)对细胞收缩型标记基因和蛋白以及炎症表型基因的影响。结果表明随着Mg~(2+)含量的增加,VSMC收缩型分子标记基因的表达降低而炎性表型的分子标记基因的表达增强。说明镁基金属腐蚀释放的可溶性Mg~(2+)可能部分介导了 VSMC从收缩型向炎性表型转变的发生。最后,本文分析了浸提液和单一镁离子添加对共培养的收缩型VSMC中两个关键转录调控因子Myocardin及Klf4表达的影响。结果发现,VSMC收缩型性状基因的促进性调控因子Myocardin的mRNA和蛋白水平均随着处理时间下降、且和处理浓度相关;而抑制性的转录因子Klf4的表达则被显著提高。说明镁基金属腐蚀释放的镁离子可引起两个转录调控因子表达水平的逆转、介导了收缩型VSMC向炎性表型转化的发生。
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【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08;TG146.22

【参考文献】