【摘要】：第一部分：基质金属蛋白酶酶解控释血管内皮生长因子聚乙二醇水凝胶制备与鉴定 第一节四枝化状丙烯酰化聚乙二醇的合成与鉴定 目的：运用接枝聚合方法制备四枝化状丙烯酰化聚乙二醇(4branched-PEG-DA),并鉴定其化学结构及属性是否符合实验设计要求。 方法：以分子量20,000Da线性聚乙二醇(PEG)单体为原料,通过四步合成方法,在单体末端引入四个丙烯酰基双键官能团。经红外光谱、1H核磁波谱、高效液相色谱、基质辅助激光解吸电离及凝胶过滤色谱检测聚合物产品在分子结构、目标官能团置换度、终产物产率、分子量及产物纯度方面是否符合实验设计、满足后续实验要求。 结果：自制4branched-PEG-DA产物经红外光谱、1H核磁共振检测证实分子结构与设计相符、末端双键官能团置换度96.3%；高效液相色谱检测显示产物纯度为98.4%；基质辅助激光解吸电离检测提示产物实际平均分子量与设计结构分子量相符；凝胶过滤色谱检测结果显示产物多分散性数值为1.02,产物分子量均一,纯度较高。 结论：通过接枝聚合方法制备4branched-PEG-DA在分子结构、目标官能团置换度、终产物产率、分子量及产物纯度方面均符合实验设计、满足后续实验要求。 第二节基质金属蛋白酶酶解控释血管内皮生长因子聚乙二醇水凝胶制备及释药性能研究 目的：制备基质金属蛋白酶酶解控释血管内皮生长因子聚乙二醇水凝胶(VEGF-MMP多肽PEG gel),观察其形貌结构并研究酶解控释效应,为后续实验奠定基础。 方法：运用9-芴甲氧羰基(Fmoc)多肽固相法合成含有巯基(-SH)的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)底物多肽。利用4branched-PEG-DA与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165, VEGF-165)共价结合后,根据Michael加成反应原理,与含有巯基的MMP底物多肽结合生成VEGF载药聚乙二醇水凝胶(VEGF-MMP多肽PEG gel)。通过大体形态及扫描电镜观察VEGF-MMP多肽-PEG gel形貌及微观结构。运用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)与VEGF-MMP多肽PEG gel之间酶解释药的关系。 结果：室温下VEGF-MMP多肽PEG gel大体形态为透明果冻状。经扫描电镜观察,水凝胶表面微观形态呈网状。其中对MMP敏感的VEGF-MMP多肽PEG gel (VEGF-MMP (W) X-PEG gel)表面孔隙平均直径为0.251±0.10lum,孔隙率为10.1±1.21%。ELISA检测结果显示,VEGF-MMP多肽-PEG gel对VEGF-165包封率为84.33±1.18%。凝胶形态崩解时相及ELISA检测结果显示,在不同浓度MMP-2作用下,VEGF-MMP (W) X-PEG gel具有稳定的VEGF释放速率。 结论：通过Michael加成反应制备的VEGF-MMP (W) X-PEG gel与MMP-2具有稳定的控释关系,满足后续实验要求。 第二部分：VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架制备及体外生物相容性研究 第一节VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架的制备与鉴定 目的：制备VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架,并通过形态学观察和免疫荧光染色鉴定是否成功构建复合支架 方法：运用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修饰去细胞瓣支架,行免疫荧光染色鉴定。根据亲和素-生物素结合原理,将含有生物素的VEGF控释水凝胶(VEGF-bio-MMP(W)X-PEG gel)与去细胞瓣支架复合,行HE染色和扫描电镜观察。 结果：结合生物素的去细胞瓣支架,经携带Cy3荧光亲和素染色,荧光显微镜显示瓣膜基质呈红色。形态学观察显示,水凝胶-去细胞瓣复合支架具有去细胞瓣三层基质结构和凝胶规则网状孔隙微观结构。 结论：按实验设计成功制备VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架。 第二节VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架体外生物相容性研究 目的：参照GB/T1688国家标准,体外研究VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架生物相容性。 方法：参照GB/T1688国家标准,对复合支架进行血液相互作用实验,研究其对血小板激活、凝血时间、溶血的影响；对复合支架及其浸提液进行细胞毒性实验,研究其对细胞增殖与凋亡的影响。 结果：经扫描电镜,流式细胞仪检测,证实复合支架可减少去细胞瓣对血小板的粘附与激活；经PT/APTT/INR检测,证实复合支架对凝血时间无明显影响；经间接、直接溶血实验,证实复合支架溶血率低于GB/T16886国家标准；经细胞增殖、凋亡检测,证实复合支架及其浸提液对MRC-5人胚肺细胞无明显影响。 结论：参照GB/T1688国家标准,VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架具有良好的生物相容性。 第三部分：智能水凝胶-去细胞瓣复合支架制备及体内生物学性能研究 第一节智能水凝胶-去细胞瓣复合支架的制备与鉴定 目的：制备抗CD34抗体-VEGF控释水凝胶-去细胞瓣复合支架(智能水凝胶-去细胞瓣复合支架),并通过免疫荧光染色鉴定是否成功构建复合支架 方法：运用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修饰去细胞瓣支架。根据亲和素-生物素结合原理,将VEGF-b i o-MMP(W)X-PEG gel与去细胞瓣支架复合。同样原理,将经生物素化抗CD34抗体与水凝胶-去细胞瓣支架复合,行免疫荧光染色鉴定。 结果：结合抗CD34抗体水凝胶-去细胞瓣复合支架,经FITC标记抗IgG抗体染色,荧光显微镜显示瓣膜基质呈绿色。 结论：按实验设计成功制备智能水凝胶-去细胞瓣复合支架。 第二节智能水凝胶-去细胞瓣复合支架体内生物学性能研究 目的：建立兔颈动脉瓣膜管道移植模型,评估智能水凝胶-去细胞瓣复合支架体内生物学性能 方法：运用改良兔颈动脉"Cuff"套管技术,建立兔颈动脉瓣膜管道移植模型。分别于术后24小时和7天,通过多普勒彩色超声检测管道通畅与否,判断动物模型建立是否成功。术后24小时,取出移植物,根据组织形态学检测,评估移植管道对CD34+细胞的粘附能力。术后7天,取出移植物,根据组织形态学检测及eNOS mRNA定量分析,评估移植管道内皮化程度。 结果：超声结果显示移植管道通畅,兔颈动脉瓣膜管道移植模型建立成功。术后24小时,相应检测结果显示,本实验制备复合支架对CD34+细胞有明显的粘附能力。术后7天,相应检测结果显示,本实验制备复合支架内皮化程度优于对照组支架。 结论：智能水凝胶-去细胞瓣复合支架具有优良的生物学性能。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R318.08
【参考文献】
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2392022
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