纳米材料对细胞染色质结构和组蛋白修饰的影响研究

发布时间：2019-03-27 15:06

【摘要】：纳米科技作为新兴的前沿科技领域,正在深化和改变着人类对客观世界的认知,也将引发一场新的工业革命,从而对经济社会未来的发展产生重要影响。纳米技术已经被应用于多个领域,在医疗卫生领域,纳米技术对疾病特别是重大疾病的早期诊断和治疗将产生深远的影响。人体接触纳米材料途径包括了吸入接触,皮肤接触,吞咽接触和眼睛接触。人体上皮细胞覆盖身体外表面和内部器官外表面,纳米材料接触人体后首先接触上皮细胞。细胞面对外界压力时,其细胞内的压力反馈机制即被触发。染色质结构的改变在反馈外界压力时扮演着重要角色,组蛋白修饰调控快速灵活且不改变DNA序列,具有可逆性,介导了常染色质和异染色质之间的动态转换,使相关的压力反应基因快速激活或者沉默,执行细胞中的生存或者死亡功能,保证个体的健康。虽然纳米生物效应与安全性已经有了大量的研究,但是由于其机制复杂,评价标准各异,因此仍需要进一步的研究,尤其是对涉及到染色质结构改变的纳米材料压力反应的研究,该研究可以成为纳米毒性评估的重要手段。本论文以正常上皮细胞和癌上皮细胞为材料,研究纳米材料诱导正常和癌上皮细胞中表现出不同的核仁紊乱的分子机制和组蛋白修饰调控,以及诱导正常上皮细胞周期阻滞和凋亡的分子机制和组蛋白修饰调控。主要内容如下：1.纳米材料诱导的不同的核仁紊乱取决于上皮细胞的癌变我们研究了纳米材料的组成,尺寸和毒性离子的溶解率对细胞存活率的影响。纳米材料包括碳纳米管(SWCNT, MWCNT 8 nm和MWCNT 50 nm)和金属氧化物纳米材料(TIO, NPs和ZnO NPs),细胞包括人类正常(HaCaT)和癌(A549)上皮细胞系。细胞存活率试验表明在暴露到1000μg/mL ZnO NPs后,相较对照,HaCaT细胞和A549细胞的存活率分别降到22.7%和38.8%,同样浓度的TIO2 NPs对被检测的细胞基本上没影响。1000μ g/mL MWCNT 8 nm处理之后,HaCaT细胞和A549细胞存活率分别降低16.2%和30.0%,但1000μ g/mL MWCNT 50 nm处理后,HaCaT细胞存活率降低10%,而A549细胞基本不受影响,SWCNT对细胞活性影响较小。这些结果表明,释放毒性离子和较小尺寸的纳米材料表现出更高的细胞毒性,细胞毒性被材料的性质,浓度和细胞类型共同决定。当细胞暴露在纳米材料中,其细胞活性被蛋白对材料的吸附性以及材料与蛋白的相互作用所影响,因此我们用流式细胞术检测了正常和癌上皮细胞中纳米材料的摄入。我们发现不同的纳米材料对于不同的细胞摄入有着差异影响,尤其是金属纳米氧化物TiO2NPs和ZnO NPs暴露后,其摄入表现出明显的增加。细胞面对外界压力的反应和整体的组蛋白甲基化和去甲基化相关,H3K9me2是细胞核上异染色质的标志。我们用免疫染色检测了纳米材料诱导的常染色质和异染色质之间的动态变化,结果显示H3K9me2信号在3小时的纳米材料暴露后就已经强烈增加,但此时纳米材料的细胞摄入和表面吸附相较于24小时并不明显,表明常染色质转变为异染色质发生在纳米材料暴露的早期。随后我们用H3K9me2和H3K9ac信号定量分析了这两种染色质状态的改变。核仁周围的异染色质能够保护核仁结构和rDNA稳定性,核仁作为压力反应器可以通过调控核仁中rDNA的RNA聚合酶Ⅰ的转录和rRNA的剪接,来保持细胞内的能量稳定。定量PCR结果显示,和对照组相比,纳米材料诱导正常上皮细胞45S rRNA前体表达降低,SWCNT降至1.60%, MWCNT8 nm降至50%,MWCNT 50 nm降至18%, TIO2 NPs降至10%, ZnO NPs降至49%。和对照组相比,癌上皮细胞45S rRNA前体表达增高,SWCNT升高194.8倍,MWCNT 8 nm升高227.9倍,MWCNT 50 nm升高241.8倍,ZnO NPs升高18.3倍。表明面对纳米材料的压力,正常上皮细胞和癌上皮细胞的45S rRNA前体转录的分子机制不一致。随后我们做了45S rDNA区域内的的H3K9ac, H4K5ac, H3K9me2, H3K27me2和H3K4me2组蛋白修饰的ChIP试验,结果显示H3K9ac,H4K5ac和H3K9me2组蛋白修饰在可能主要参与纳米材料暴露后正常上皮细胞和癌上皮细胞45S rRNA前体表达的差异改变,H3K4me2和H3K27me2可能在不同组蛋白修饰的相互影响中,部分的参与了45S rRNA前体的转录调节。2.纳米氧化锌颗粒诱导人表皮角质细胞细胞凋亡及分子遗传机理我们从表观和分子的水平,以人源永生化表皮角质细胞为实验模型,系统的研究了氧化锌纳米颗粒(ZnO NPs)对细胞的影响。在细胞活力受到抑制之前,ZnO NPs对细胞的处理使细胞周期在G2/M检验点处阻滞,这个过程还伴随着表观遗传修饰的变化,并且和随后发生的细胞凋亡反应相关。在24小时内,核染色质发生凝缩,并伴随着组蛋白H3K9甲基化水平上升,组蛋白H4K5乙酰化水平下降。与此同时,甲基转移酶基因G9a和GLP的表达量上升,乙酰转移酶基因GCN5, P300和CBP表达量下降。在ZnO NPs处理细胞6小时的过程中,细胞内的活性氧水平显著提升,24小时后观察到了DNA损伤的现象。透射电子显微镜和流式细胞检测证实培养基内添加的氧化锌纳米颗粒进入到细胞内部,并在24小时后通过扫描电子显微镜观察到凋亡小体的产生,流式细胞术证实氧化锌纳米颗粒引起了细胞的凋亡。在氧化锌纳米颗粒作用24小时后,p53-Bax线粒体介导的凋亡途径中的凋亡基因Bax, Noxa和Puma的表达量被发现显著上升,而抗凋亡基因Bcl-xl显著下调。综上我们总结出ZnO NPs可以诱导细胞周期的G2/M阻滞,这个过程与p53-Bax线粒体介导的凋亡途径相关,并伴随着表观遗传修饰的变化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;TB383.1

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本文编号：2448290