空心玻璃微球表面仿生沉积磷灰石涂层细胞微载体的研究

发布时间：2019-05-16 16:04

【摘要】：组织工程研究的主要目的是利用活细胞和生物材料,体外培养或者构建组织和器官,以修复或替代损伤的组织或器官。种子细胞是实现组织重建的前提和基础,利用微载体培养技术对组织工程种子细胞进行体外扩增,是现如今最常用、最有效的方法。目前,大多数微载体材料仍是聚合物,制备新型的生物性能优良的微载体材料仍是组织工程与再生医学比较重要的问题。羟基磷灰石(HA)具有优良的生物活性和生物相容性,被认为是一种潜在的细胞培养微载体材料。然而,因HA的理论密度较高限制了其作为微载体材料的应用。对HA复合高分子类材料的微载体已有研究,但是HA复合无机材料作为细胞培养微载体的相关研究还很少。空心玻璃微球(HGM)以其良好的物理化学性质被广泛地开发利用,在其表面涂覆不同性质的涂层,可使其具有不同的功能特性。 本研究针对HGM的物理化学性质,选择NaOH, Ca(OH)2和Piranha溶液三种不同的表面处理方式对其进行表面活化,通过简易的仿生沉积的方法在其表面沉积了HA涂层,制备出了HA-HGM复合空心微球。同时,对三种不同表面处理方式的机理进行了讨论,优化了每种处理方式的工艺参数,并对其结构和性能进行表征,确定了合适的表面处理方式。通过调整沉积时间、模拟体液(SBF)的浓度、液固比等参数,分别利用X射线衍射仪(XRD)、红外光谱分析仪(FTIR)、场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、比表面积分析仪(SSA)、高分辨透射电镜(HRTEM)、X射线光电子能谱仪(XPS)、扫描探针显微镜(SPM)等手段对涂层的相组成、原子团、形貌、比表面积、微观结构、表面成分以及表面粗糙度进行了系统的分析,优化出沉积工艺,并探索了煅烧对HA涂层微观结构和性能的影响。在此基础上,选取了两种HA-HGM复合空心微球,对MC3T3成骨细胞进行细胞培养,通过MTT法检测了细胞的增殖率,并检测了碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞分泌蛋白的功能,初步研究了HA-HGM复合空心微球作为成骨细胞培养微载体的性能。 结果表明,HGM主要组成成分是Si02和A1203,呈中空灰白色的规则球形,表面光滑,主要由短棒状的晶体和非晶玻璃体组成。三种表面处理方式均可激发HGM的化学活性,激发的机理有所不同,但是关键还是使Si-O键和Al-O键断裂,破坏其Si-O-Si或Si-O-A1网络结构。经过三种方式不同表面处理后,利用仿生沉积法均可在HGM表面沉积碳酸化的HA。通过分析HA涂层的结构和性能,以操作简便易行和无危险性为原则,选择最优的表面处理方式是HGM在1mol/L NaOH溶液中于36.5℃下处理2h。 沉积时间、SBF的浓度以及液固比等条件对沉积层HA的结构和性能有明显的影响。随着沉积时间的延长,HA涂层的厚度不断增加,沉积速度约为0.14μm/dayo沉积时间延长到15天后,沉积层的生长速度变得缓慢,浸泡18天后生长进入平台期。这主要是由于沉积层厚度增加,使得作为HA的形核点的富硅层溶解出的速度降低引起的。同时,浸泡时间为15天时,涂层表面部分出现微裂纹,而且随浸泡时间的继续延长,微裂纹增加,甚至使涂层从HGM表面脱落。在低浓度的SBF溶液中,HGM表面不能沉积HA涂层,只有在1.5倍以上浓度的SBF溶液中才能顺利沉积HA涂层。SBF浓度增大对沉积层生长速度的影响并不明显。液固比也是影响沉积层性能的一个重要因素,研究表明,在1.5SBF溶液中,只有液固比在高于150：1以上才能沉积HA涂层。在本研究条件下,合适的工艺参数是无生物玻璃活化,1.5SBF,液固比150：1,沉积时间15天。 仿生沉积的HA涂层表面以片状的结构相互交错,弯曲排列而成,形成花瓣状。涂层的结晶度不高,并且是含有碳酸根的类骨磷灰石,厚度约为2μm,孔径大小约为100nm,可以促进细胞在材料表面的响应,有利于细胞的黏附与增殖和营养物质的传递功能。HA沉积层由近基体的致密层和近表面的多孔疏松层的双层结构组成。 在500-800℃之间对微球进行煅烧处理,总体上随煅烧温度升高,HA涂层的比表面积迅速降低,孔径尺寸不断增大,花瓣状多孔形貌消失,逐渐由纳米颗粒代替。煅烧温度为600℃时,总孔体积最大(0.0359ml／g),孔分布均匀。这主要是因为煅烧过程中碳酸根不断从HA涂层晶体中释放出来,同时,多孔花瓣状结构变成均匀的纳米颗粒组成的多孔网状结构。煅烧温度升高到700℃时,沉积层内晶体结构发生变化生成磷酸三钙(TCP)。HRTEM结果表明,沉积层HA中含有少量的非晶,片状结构存在于整个涂层中。经过煅烧处理后,组成HA的颗粒成棒状结构,结晶度升高,表面粗糙度先降低后升高。 选取未煅烧(HA-w)和600℃(HA-600)煅烧30min的HA-HGM复合空心微球为研究对象,以MC3T3成骨细胞为目标细胞,研究了复合微球对成骨细胞培养的能力。研究表明,对MC3T3培养24h后,成骨细胞能较好的在空心微球表面进行黏附和铺展。煅烧后的样品,因HA涂层与基体HGM结合强度降低,使得在细胞培养过程中部分涂层发生脱落现象,对细胞培养和形貌观察造成了不利影响。而且发现,成骨细胞在HGM基体上呈现薄膜状态,无细胞核存在,这说明HGM本身不利于成骨细胞的生长。 HA-HGM复合空心微球表面具有良好的生物相容性和活性,同时,在培养板中又增加了培养的面积。因此,MTT试验表明成骨细胞在HA-w微球存在下的增殖率高于空白对照组的增殖率。成骨细胞功能检测也表明,实验组ALP的活性要高于空白对照组。试验表明,HGM表面仿生沉积HA涂层所得到的HA-HGM复合空心微球适用于成骨细胞的大规模培养。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08

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本文编号：2478393