双光子成像量化观测小鼠卵母细胞染色体三维构象

发布时间：2019-07-27 09:42

【摘要】：卵母细胞成熟要经历两次减数分裂过程，染色质逐渐卷曲凝聚成染色体。此过程中染色体构象(指染色体空间位置、形态、分布等)经历了许多复杂变化。如何可视化并原位定量分析染色体构象的“时-空”四维发育特点，对认识复杂的遗传与变异过程，及探讨重大疾病的机理有重要作用。由于卵母细胞体积大、光散射强、对发育环境敏感，因此要在微干扰条件下，原位观测并量化分析卵母细胞染色体三维构象随发育的变化特点，存在较大困难，目前此类研究较少。本文利用穿透能力强、光损伤性小、三维分辨率高的双光子荧光成像系统和图像重构技术，提出量化分析卵母细胞染色体构象的方法，尝试通过染色体体积、表面积、类球因子（RF）、平均距离、粘连程度、包裹染色体圆柱的高宽比（H/D）等指标定量描述染色体的形态、形貌、空间分布等构象特点。并将该方法应用于诱发有机体生理环境改变的内因“衰老”和外因“氨甲喋呤（MTX）”对小鼠卵母细胞染色体构象影响的研究中。我们的研究结果表明：衰老导致卵母细胞质量下降。在第一次减数分裂前中期和中期，衰老干扰染色体的正常凝聚，引起染色体平均体积和表面积增大，平均距离缩短，粘连加重，形成团状体。在第二次减数分裂中期，衰老增加了小鼠体内成熟卵母细胞染色体错误排列的几率，并造成染色体的总体积、总表面积、H/D值增大。衰老还影响了卵胞质内DNA甲基转移酶蛋白的空间定位及表达水平。 MTX是常用的抗肿瘤药物，但其具有干扰叶酸代谢功能，可能引起生殖异常。实验结果表明，腹腔注射MTX可造成小鼠体内成熟卵母细胞染色体异常空间排布比率升高、纺锤体形态改变。亚叶酸钙和自身代谢两种回救方式都可缓解MTX对体内成熟卵母细胞的毒副影响，恢复染色体空间排布及纺锤体形态至正常状态。本文还提出一种实时观测减数分裂纺锤体四维运动的便捷方法，并通过空间位置、速度、加速度等指标量化分析其运动特点。该方法基于我们观察到的一种重要实验现象：无损染料Fura-2标记小鼠活卵母细胞内钙离子，由于Fura-2与钙离子结合后双光子激发截面减小，钙离子的聚集使第一次减数分裂中期染色体赤道板两侧的纺锤体区域，形成两个对称荧光弱区。此现象即荧光弱区与纺锤体共定位，通过实时追踪活卵母细胞内荧光弱区的运动，可获知纺锤体的动态行为。
【图文】：

.1 Jablonski 能级图。S 代表自旋单重态，T 代表自旋三重态。S0、S1、S2、T1代同电子能级。v=0-5 代表不同振动能态。.2 荧光产生的其他相关概念1.荧光漂白

双光子成像量化观测小鼠卵母细胞染色体三维构象

4.荧光激发光谱与发射光谱[26, 30, 34]荧光激发光谱是指物质发射荧光强度随激发光波长变化而得到的光谱（图2.2）。该光谱反映的是荧光物质在固定的最大荧光强度所对应的发射波长处，通过改变激发光的波长，检测荧光强度随激发光波长的变化关系。激发光谱显示荧光物质的有效吸收波长范围，，同时显示出荧光强度与激发光波长之间的依赖关系。故此本质上激发光谱体现的是不同波长入射光激发荧光的相对效率。另外荧光物质的激发光谱与吸收光谱形态相同，二者可相互替代，物理含义相同。荧光发射光谱又称荧光光谱，是反映物质发射荧光强度与荧光波长间关系的谱线（图 2.2）。荧光光谱是在固定激发光波长下记录荧光物质发射不同波长的荧光强度，它体现了发射荧光中各种波长组分的相对强度。对于绝大多数荧光物质，其发射光谱形状与入射光波长无关。这是因为荧光产生在高电子能级的最低振动态与基态各振动能级之间，而与荧光物质分子被激发至高电子能级的哪一振动态无关。物质的激发与发射光谱反映了该物质基态与激发态间能量的跃迁。物质吸收入射光从基态跃迁至激发态的过程可由激发光谱表征，随后释放能量从激发态返回基态的过程又可用发射光谱表征。在荧光物质的使用过程中，应根据其激发与发射光谱，选择能够激发出最大荧光强度的入射光波长，同理选择最灵敏的发射光波长用于检测。另外物质的激发与发射光谱还可用于鉴别该荧光物质。因为每种荧光物质都有特定的激发与发射光谱。
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R321.1;R318.51

【参考文献】