基于三维打印技术的载药抗结核骨支架的构建与特性研究

发布时间：2019-08-10 12:47

【摘要】：肺结核病是一个很古老的疾病,目前为我国的乙类传染性疾病,新中国成立以来,结核病得到了一定程度的控制,但近年来全球肺结核病例有卷土重来之势,作为肺外结核常见并发症之一的骨关节结核,由于其存在的难治性及复发性,已成为医学上的一项重大挑战。传统治疗骨结核的方法主要是全身化疗与手术治疗相结合,全身给药存在着骨结核病灶处药物浓度低以及肝肾毒性大等问题,手术治疗也存在着病灶局部的复发以及骨缺损的问题。故一种能在病灶局部持续有效地释放抗结核药物,并能修复骨缺损的一种载药支架材料在骨结核的治疗中尤为重要。目前研制的不同载药支架,都存在着载药单一、释药节律过快或过慢,以及材料无法降解、成骨能力差等问题。因此,研制出一种包埋多种药物并能按照一定节律释放的骨支架材料成为一大挑战。载药材料的选择以及缓释体系的设计是这一研究的关键。有序介孔材料,由于比表面积和孔容较高,孔道结构规则有序、孔径尺度在纳米范围、孔道表面易采用化学方法修饰以及生物相容性优良等一系列优点,在生物医药领域的药物载体方面具有较大的潜力。介孔生物活性玻璃(MBG)具有比传统方法制备的生物玻璃更好的沉积羟基磷灰石的能力,作为具有良好生物活性的药物载体得到广泛研究。将MBG与高分子材料复合制备支架,不仅会克服纯MBG无机支架过于脆弱的缺点,也可改善聚合物支架的生物活性和药物输送性能。基于MBG材料表现出的良好生物活性和药物缓释性能,可将其应用于载药缓释支架的构建。三维打印(3D-Printing)技术可以在计算机辅助下,根据计算机辅助设计(CAD)模型或者电子计算机断层扫描(CT)数据,通过材料的精确堆积为临床医学量身定做特定生物材料制品。不同的材料及药物可根据需要调整比例后通过粘合剂进行混合后方便打印,可适用的成型材料类型众多,对于复杂空间结构的支架在制备上有其独特优势,通过逐层打印、层层叠加可精确的控制支架的结构,设计出来的支架材料在生物力学强度及孔隙率方面在一定程度上可控。由于三维打印技术在支架材料的设计上具有打印生物材料种类多、打印精度高、集成化程度好和操作方便等特点,在生物组织工程及药物控释方面得到广泛应用。近年来关于三维打印技术用于制备MBG支架及其复合支架已有相关报道。本研究针对骨结核术后局部骨缺损的修复及原位药物化疗的需要,采用三维打印技术设计制备装载有异烟肼及利福平两种抗结核药物的MBG/PHBHHX(聚3-羟基丁酸-共-3-羟基己酸)复合支架。该支架中功能化后的不同孔径和表面性质的MBG可区别装载高量的一线抗结核药异烟肼和利福平,介孔限域、表面化学基团以及PHBHHX的逐步降解共同作用,实现尽可能长时间的药物缓慢释放。这种研究思路制备的载药支架满足联合、高量及缓释的临床化疗要求,不仅具有很高的科研学术价值,也具有重要的实际应用价值,有望为载药缓释支架研究提供新的发展,具有创新性。实验第一部分:载药复合骨支架(DLCS)的制备与表征目的:旨在通过三维打印技术制备MBG/PHBHHX载药抗结核复合骨支架(DLCS),采用TEM及SEM手段明确其形貌特征,并对其基本的理化性能及生物学活性进行检测。方法:选择三嵌段共聚物表面活性剂P123,采用挥发诱导自组装方法,制备MBG粉体;在MBG的介孔孔道表面分别嫁接亲水羧基和疏水甲基进行化学改性后用于担载抗结核药异烟肼和利福平;将载药MBG粉体与PHBHHX配制成合适于打印的浆料后,置于三维打印机中制备出直径为6mm,高为8mm的圆柱体复合载药骨支架,命名为DLCS,同时采用浸滞法制备对照组载药支架,命名为commercial Cap。应用扫描电镜观察分析复合骨支架的晶相组成及微观形貌,检测支架的抗压强度及孔隙率等理化性能,并通过检测DLCS沉积羟基磷灰石的能力、成骨细胞粘附的能力及其对碱性磷酸酶(ALP)活性的影响来评估DLCS的生物学活性。结果:我们采用三维打印技术成功制备出了MBG/PHBHHx载药复合骨支架,该支架材料的孔隙率为72.55±1.91(%),发生20%行变时的平均抗压强度为3.15±0.69MPa,SEM扫描显示DLCS表面具有较多的孔隙,孔序分布均匀,孔隙率较大,层与层之间排列紧密,结构稳定。DLCS具有较好的沉积羟基磷灰石的能力,h BMSC细胞在支架表面黏附情况良好,ALP活性检测显示DLCS组与对照组差异不明显(p0.05),而较空白组的ALP活性低(p0.05),这与其载药后药物的释放对细胞的影响有关,但随着天数的增加,实验组及对照组中的ALP活性均出现明显增强,说明DLCS仍具备良好的成骨性能。结论:通过三维打印技术可成功制备MBG/PHBHHx载药复合骨支架,该支架具有较好的生物学活性,结构稳定,能较好的装载两种抗结核药物,且具有一定的抗压强度,可为载药人工骨支架的研究提供一种新的理论支持。实验第二部分:DLCS的体内外药物释放特性及其对肝肾功能影响的研究目的:旨在检测DLCS在体外模拟体液(SBF)及新西兰大耳白兔体内的药物释放节律及特性,从而评估DLCS在药物缓释方面的性能,并检测其在各不同时间段对动物机体肝肾功能的影响。方法:取DLCS及对照组材料(commercial Cap)各0.1g分别浸渍到20ml的SBF液后,置于恒温振荡器中。间隔相应时间段取样并更换同体积SBF液。用HPLC检测并计算每次所取介质INH、RFP的浓度,总结其在体外释药特性。DLCS及对照组材料各0.1g植入新西兰大白兔的股骨下段骨缺损处,术后间隔相应时间段取静脉血及材料植入处周围组织,采用HPLC法检测并计算对应INH和RFP的浓度,总结其在体内释药特性。间隔相应时间段对空白组、实验组及对照组的肝肾功能进行检测,评价材料释药对动物肝肾功能的影响。结果:体外模拟实验显示对照组INH及RFP两种药物的释放量在第2w左右已接近100%,而实验组INH和RFP分别在6w和4w左右释放量接近80%,第10w仍未释放完全。动物体内实验显示DLCS组局部浓度12w时仍在最低抑菌浓度(MIC:INH0.05μg/ml,RFP0.5μg/ml)之上,而对照组局部浓度4w时已降至最低抑菌浓度之下。血液中药物浓度明显低于材料周围组织浓度,大部分为5ug/ml以下。肝肾功能检测结果显示实验组中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)术后第7d及2w出现一过性升高,整个实验过程中尿素氮(BUN)及肌酐(CR)值一直无明显升高。结论:DLCS载药量满意,体外及体内药物缓释节律均较对照组明显缓慢,释放性能稳定,在体内局部组织中有效抑菌时间可达12w以上,可满足骨结核术后局部化疗的需要。DLCS的释药过程对新西兰兔肝肾功能影响不大,仅对AST及ALT有一过性影响。实验第三部分:DLCS的生物安全性及成骨能力研究目的:对DLCS的生物安全性进行评估,以证实其符合生物材料的应用标准;对DLCS的动物体内成骨性能进行检测,以证实其修复骨缺损的能力。方法:采用CCK-8法检测DLCS的细胞毒性,并在动物体内行DLCS的急性全身毒性实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和致敏实验检测,评价实验材料的生物相容性和安全性。同实验第二部分,建立兔股骨骨缺损模型,实验组、对照组及空白组各两组,每组3只,术后6w及12w分批处死,大体观察后,取骨缺损区域组织行Micro-CT扫描及硬组织切片检查,研究DLCS对骨缺损的修复能力。结果:CCK-8法检测结果显示各个时间段细胞的存活率CV均在80%以上,依据细胞毒性评价标准评估为1级,符合生物材料使用标准。动物急性全身毒性实验、原发性皮肤刺激实验、皮内刺激实验和致敏实验均显示DLCS毒性较低,与机体具有较好的生物相容性,生物安全性良好。在兔股骨骨缺损修复过程中,实验组和材料对照组修复情况类似,较空白组具有明显优势。结论:DLCS无明显细胞毒性,具有良好的生物相容性和安全性,对细胞的毒性评估符合生物材料使用标准。DLCS具有较强的诱导成骨能力,其应用于骨关节结核术后骨缺损的治疗,能促进骨缺损的愈合,具有较强的临床应用价值。
【图文】：

示意图,骨内植入,支架,示意图

10]，其加载药物方式与前述图1中c线路类似，即将药物粉体和载体材料粉体机械混合或是溶解到聚合物溶液中，再一次性进行支架成型。这种单一的混合方式难以实现对不同药物的区别装载及可控释放。因此，研究开发符合高量联合装药及可控释放要求的抗结核药物缓释支架，，仍是非常具有挑战性的工作，其中药物载体材料的选择和支架结构的设计是关键所在。图 1 骨内植入支架载药的不同途径示意图二、介孔生物活性玻璃（MBG）在骨组织工程中的应用有序介孔材料，由于具有极高的比表面积和孔容，规则有序的孔道结构、可调的纳米尺度孔径、易于化学修饰的孔道表面以及优良的生物相容性等一系列优点，在生物医药领域的药物载体方向展现出巨大的潜力[11-12]。介孔材料的孔径大小、孔道类型、比表面积等参数则会影响到药物的负载和释放特性。但是，介孔氧化硅因为没有生物活性或者说生物活性很低[13]，并不适用于骨组织工程。2004 年

第四代3D-Bioplottersystem(EnvisionTEC,Germany)
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687;R318.08

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