马羊膜上皮细胞的分离、培养、鉴定及分化潜能的研究

发布时间：2019-08-24 12:24

【摘要】：羊膜上皮细胞(Amniotic Epithelial Cells,AECs)来自于胎盘内层羊膜。羊膜组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮细胞(AECs)和来源于中胚层的羊膜间充质细胞(amniotic mesenchyme cells,AMCs)两类细胞组成。已有研究成果证明羊膜上皮细胞仍保持前原肠胚时期胚胎细胞的可塑性和多能性,具有三种胚原基层细胞的分化潜能,能够分化成为内胚层、中胚层和外胚层细胞。早在40年前科研人员已经在羊水中发现了干细胞,2003年科研人员又发现羊水中的某些细胞能够表达干细胞全能性标志性基因Oct4。2005年美国University of Pittsburgh的Miki等报道了hAECs具有胚胎干细胞的特性,并证实hAECs和胚胎干细胞一样表达特异性转录因子(transcription factor,TF)“Oct4”和“Nanog”基因。hAECs取材方便、来源广泛、易于培养、免疫原性低、不形成畸胎瘤,成为再生医学组织工程学和细胞替代治疗领域非常有应用前景的生物工程材料。目前人羊膜细胞的研究取得了显著成果,临床上已经用于治疗肝病、心脏病、神经系统疾病、糖尿病、肺病等多种疑难杂症。近几年动物羊膜细胞的研究工作也取得了明显的进展,到目前为止,绵羊羊膜和羊水干细胞、猪羊水干细胞、马羊水干细胞、水牛羊水干细胞、牛羊膜和羊水干细胞等都已经分离成功。马羊膜上皮细胞(equine Amniotic Epithelial Cells,eAECs)研究报道的资料较少,而有关eAECs分离、培养和鉴定等研究内容尚未见报道。本论文采用Trypsin和TrypLE消化羊膜上皮细胞层获得eAECs,在一定条件下进行体外培养,通过免疫荧光染色、流式细胞技术、RT-PCR检测等方法对eAECs表达上皮细胞表面抗原、干细胞表面抗原进行鉴定,并进一步对eAECs体外和体内的分化潜能进行研究,来评估马羊膜干细胞在临床治疗方面的应用前景。实验首先对马羊膜上皮细胞(eAECs)进行分离与培养。目前还没有关于马羊膜上皮细胞(eAECs)消化分离及体外培养实验方法的报道。本实验以人羊膜上皮细胞消化分离方法为参考依据,建立了马羊膜上皮细胞(eAECs)消化分离的实验方法,并对Trypsin和TrypLE在eAECs分离培养过程中的影响作用做了相关的研究。实验结果显示Trypsin和TrypLE都可以从马羊膜层消化分离获得上皮原代细胞,但TrypLE更有利于马羊膜上皮细胞的分离消化,获得的细胞活力高,对以后的细胞传代培养影响较小,更适宜于后续的细胞培养、鉴定和分化潜能的研究。实验采用90%fbs+10%dmso的细胞冷冻液体系冻存细胞效果较好,将细胞悬液和冻存液混合放入冻存管后置于异丙醇冷冻盒内,-80℃条件下过夜,第二天转入液氮长期保存以备实验使用。实验过程发现羊膜上皮细胞在体外培养时出现了三种细胞类型,上皮样细胞、间充质样细胞、半贴壁园形细胞。经trypsin消化分离获得的马羊膜上皮细胞在初代和第一代培养时,其倍增时间较tryple分离获得的细胞的倍增时间长,而以后传代细胞的倍增时间两者没有明显差异,在体外培养马羊膜上皮细胞的倍增时间平均为1.25天左右。实验进一步对马羊膜上皮细胞(eaecs)进行鉴定。第二代马羊膜上皮细胞经过免疫荧光染色结果发现ssea-1、ssea-3、ssea-4、tra-1-60和tra-1-81均在细胞质中呈阳性表达;oct4在细胞核中呈阳性表达;rt-pcr检测表明马羊膜上皮细胞(eaecs)在mrna水平上表达胚胎干细胞标志性基因oct4、nanog和sox2;流式细胞术检测(facs)发现马羊膜上皮细胞(eaecs)表达上皮细胞特异性表面抗原cd44、cd90、cd105,但不表达骨髓上皮细胞cd45。这些结果表明,实验分离得到纯度较高的马羊膜上皮细胞,且马羊膜上皮细胞表达胚胎干细胞自我更新和标志性基因,具有干细胞特征,可以认为马羊膜上皮细胞(eaecs)是马羊膜上皮干细胞(eaescs)。最后实验对马羊膜上皮细胞(eaecs)分化潜能进行探索性研究。实验通过体外培养向三胚层自发分化和给scid小鼠注射马羊膜上皮细胞(eaecs)的体内分化实验对马羊膜上皮细胞(eaecs)分化潜能进行研究。在体外悬浮培养马羊膜上皮细胞,20天后发现形成了类胚体,经rt-pcr检测发现马羊膜上皮细胞在体外自发分化的细胞都表达外胚层、中胚层和内胚层三个胚层的标志性基因β-tubuliniii、gata-4和α-fetoprotein。在给scid小鼠皮下注射马羊膜上皮细胞后,30-90天之间没有发现畸胎瘤发生;而对照组给scid小鼠皮下注射了商品化的小鼠胚胎干细胞,90天后处死小鼠后检查发现有畸胎瘤形成,结果表明实验分离获得的马羊膜上皮细胞(eaecs)免疫原性低于小鼠胚胎干细胞,更适合临床治疗的研究。综上所述,本实验获得了具有干细胞特征的马羊膜上皮细胞(eaecs),初步建立了消化分离的实验方法;并对马羊膜上皮细胞的体内、体外分化潜能及免疫原性进行了探索性研究。实验结果表明马羊膜上皮细胞(eaecs)可以向三个胚层的细胞分化,这为今后再生医学和组织工程学通过干细胞定向治疗临床上所需的细胞或组织器官提供了新的实验基础和依据,对以后开展其它动物羊膜上皮细胞的研究也有积极的借鉴意义,使得人们对马羊膜上皮细胞(eAECs)的认识又前进了一步。
【图文】：

图 2-1. 马胎衣、羊膜和绒毛膜的比较图A: 马完整胎衣（包括羊膜、绒毛膜和胎盘组织）B: 血管分布少的胎膜。黑色箭头所指为羊膜上皮层；白色箭头所指为绒毛膜，其上血管较多。Fig. 2-1. The comparison of afterbirth, amniotic membrane and chorionic.A: The complete afterbirth (including amniotic membrane, chorionic and placental tissue). B: The membrane with less vasculardistribution. The black arrow designates the amniotic membrane cortex; White arrow designates the chorion with more blood vessels.在无菌条件下，取实验材料将羊膜上皮层从绒毛膜上机械剥离下来，置于高压灭菌的500ml含0.3 mg/ml 庆大霉素的生理盐水中洗涤3次。剔除羊膜层上残留的血管，清洗 3 次后，在 70%消毒酒精中浸泡 5s，然后再用 D-PBS 反复冲洗。最后将羊膜剪成大约 10cm2小块，置于 500ml 无菌试剂瓶中，称重后用于细胞消化实验。用同样的方法将所有的羊膜分离完成后，无菌条件下冷冻存放备用。2.2.2 Trypsin-EDTA 或 TrypLE 消化分离马羊膜细胞在准备好的 500ml 无菌试剂瓶按每克羊膜加入 1 ml 0.25%Trypsin-EDTA 或者TrypLE，充分混匀后置于预热到 37℃的空气恒温摇床中，进行消化分离实验。

38马羊膜上皮细胞的分离、培养、鉴定及分化潜能的研究2.3.2 马羊膜上皮细胞的培养本实验采用 Trypsin 或者是 TrypLE 分别消化分离所获得的马羊膜细胞液在体培养时，P0 细胞在显微镜下观察到了 3 种形态的细胞，即为半贴壁圆形细胞、贴上皮样细胞和贴壁间充质样细胞，，说明消化分离所获得的细胞液是一个混合细胞（图 2-3）。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q813.1;R318.08

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本文编号：2528960