重组腺病毒介导siCXCR2抑制磨损颗粒诱导破骨细胞分化成熟的作用

发布时间：2019-09-13 01:27

【摘要】：背景:人工关节置换术在治疗骨性关节炎、风湿性关节炎、老年髋关节骨折等方面已经取得巨大成功,能够明显改善病人运动功能和生活质量。磨损颗粒诱导的植体周围松动是全关节置换术病人术后最常见的远期并发症,严重影响病人生存质量。人工关节置换术后产生的磨损颗粒及副产物可导致局部的慢性炎症反应和异物反应从而刺激破骨细胞分化成熟造成局部溶骨最终导致无菌松动。有效的抑制破骨细胞过度分化成熟能够改善全关节置换术成功率及远期疗效。最近几年研究发现,植体周围局部炎症反应是促进破骨细胞分化成熟的重要因素之一,且IL-8在破骨细胞成熟分化中起着重要作用。因此,我们课题组采用腺病毒干扰技术沉默IL-8的受体CXCR2,针对IL-8/CXCR2通路研究CXCR2在磨损颗粒诱导破骨细胞过度分化成熟中发挥的作用。目的:体内构建小鼠颅骨骨溶解模型,观察si RNA-CXCR2是否具有抑制破骨细胞分化成熟及局部骨溶解的作用。体外培养原代破骨细胞和原代成骨细胞,观察si CXCR2是否具有直接和间接调控破骨细胞分化成熟的作用。方法:1.体外实验:(1)建立破骨细胞株(RAW264.7)培养体系培养破骨细胞株RAW264.7,运用流式细胞术技术,观察破骨细胞成熟分化刺激因子RANKL诱导破骨细胞株RAW264.7分化过程中对RAW264.7细胞表面CXCR2表达的影响。(2)建立原代破骨细胞培养体系使用si CXCR2成功转染原代破骨细胞后,运用Western blot、Real-Time PCR、抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)等实验技术检测破骨细胞标志性蛋白及基因的表达,及细胞中RANKL/RANK信号系统下游关键转录因子(c-Fo S,NFATc1,Ctsk)基因的表达变化。观察IL-8/CXCR2通路直接调控破骨细胞成熟分化的作用。(3)建立原代成骨细胞培养体系使用si CXCR2成功转染原代成骨细胞后,运用Western blot、Real-Time PCR检测成骨细胞中OPG、RANKL在蛋白水平及基因水平的表达情况。观察IL-8/CXCR2通路是否作用于成骨细胞间接调控破骨细胞成熟分化的作用。2.体内实验:首先构建钛颗粒诱导小鼠颅骨骨溶解模型。运用Real-Time PCR、TRAP染色、免疫组织化学、micro-CT等实验方法,检测各组模型局部破骨细胞数量及局部溶骨情况。观察si CXCR2在体内实验中是否具有抑制磨损颗粒诱导破骨细胞过度成熟分化,有效抑制局部溶骨的作用。结果:1.经过RANKL刺激后的RAW264.7破骨细胞株表面CXCR2表达明显上调。2.通过体外培养原代破骨细胞及原代成骨细胞,观察到si CXCR2可以直接作用于破骨细胞前体细胞抑制其向具有溶骨作用成熟破骨细胞分化,间接作用于成骨细胞,调控OPG、RANKL的表达从而抑制破骨细胞分化成熟。3.在钛颗粒诱小鼠颅骨骨溶解模型中,通过沉默CXCR2基因的表达,可以明显抑制由于破骨细胞过度分化造成的局部骨溶解。结论:本课题证实了IL-8/CXCR2信号通路在破骨细胞成熟分化中起重要作用。局部注射重组腺病毒si CXCR2可以有效抑制磨损颗粒诱导的破骨细胞过度分化成熟与局部溶骨现象。IL-8/CXCR2信号通路可直接和间接调控破骨细胞分化成熟并有可能成为因局部溶骨造成无菌松动治疗的新靶点。
【图文】：

图 1 磨损颗粒诱导趋化因子表达和细胞迁移[12]Fig.1 Wear particles induced chemokine expression and cellular migration.

图 1 RANKL 刺激 RAW264.7 成熟分化过程中上调 CXCR2 表达e 1. CXCR2 is upregulated during RANKL-induced osteoclastogenesis in RAW264.7 cells were treated with M-CSF (30 ng/ml) with or without RANKL(100 nA. CXCR2-positive stained cells were analyzed using FACS with anti-CXCR2 atal CXCR2 protein levels were increased in the RANKLgroup. Western blottinalyze CXCR2 protein expression in cell lysates. Thirty micrograms of protein winto each lane; β-actin was used as a loading control. *P<0.05.腺病毒siCXCR2筛选重组腺病毒购买自上海汉恒生物科技有限公司，产品提供了4组供选择使用，分别标号为 1、2、3、4。我们需要使用 Western blottin效果最好的一组病毒用于后续实验。经过检测发现 1 号病毒沉默效
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687.4;R318.08

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本文编号：2535481