L-RADA16-RGD自组装短肽纳米羟基磷灰石复合材料制备、生物学特性的实验研究

发布时间：2019-09-24 03:15

【摘要】：目的制备L-RADA16-RGD自组装短肽纳米羟基磷灰石复合材料,利用L-RADA16-RGD材料所形成的三维网状结构促进细胞增殖粘附,利用RGD基团促进成骨分化,烧结成多孔纳米羟基磷灰石提供一定强度的力学支持。通过材料学检测、体内外实验分析评价复合材料其结构构成、测试其性能、观察其体内外的生物安全性、生物相容性及生物活性。方法1.将n HA与发泡剂按50:1比例进行研磨混合,将混合物在1500℃的高温条件下烧结5小时。将烧结后的n HA多孔材料采用不同模具制备力学样条、小方片、小圆片,再与液态L-RADA16-RGD按体积比1:1混合。使用扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM),透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察材料表征。2.按照上述方法制备L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料,将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)与复合材料进行共培养,通过CCK-8检测细胞增殖、流式细胞学检测细胞周期来评价该复合材料对细胞的生物相容性及细胞毒性。3.将MC3T3-E1细胞与n HA/L-RADA16-RGD复合材料所制备的小圆片在6孔板中进行共培养,对MC3T3-E1行成骨诱导培养,通过茜素红染色观察钙结节形成、蛋白免疫印迹实验(western blot,WB)检测I型胶原、骨桥蛋白、骨钙素等成骨相关蛋白的表达情况,评价该生物材料的生物活性。4.在SD大鼠外侧股骨髁建立骨缺损模型,分别植入由n HA/L-RADA16-RGD复合材料所制备的多孔骨填充材料及单纯多孔n HA骨填充材料,观察点设置为填充材料植入后30天、60天。采用微计算机断层扫描(micro computed temography,Micro-CT)及组织学染色观察植入材料周围骨生长情况、植入材料与骨的界面结合情况,同时进行动物肝肾功生化指标检测、肝肾组织学检测,以综合评价L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料的生物安全性、生物相容性及生物活性。结果1.通过SEM与TEM观察所制备的样本可见多孔材料表征,验证L-RADA16-RGD多肽材料成三维网状结构,观察到L-RADA16-RGD多肽与多孔n HA材料进行物理结合,L-RADA16-RGD多肽在多孔n HA孔隙之间形成三维网状支架结构,孔隙率71.95±1.77%,孔径大小为203±17nm。。2.通过CCK-8检测MC3T3-E1细胞与L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料共培养后的细胞增殖情况,通过与多孔n HA材料组及空白对照组对比,可以得知三组的细胞增殖情况随培养时间的延长均呈上升趋势,在各观察时间点,三组细胞的增殖情况相似,差异无统计学意义(P0.05)。另外,流式细胞检测细胞周期提示,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组、多孔n HA材料组及空白对照组在不同观察时间点细胞周期情况分别为:各组中的第1天及第7天细胞周期情况相似,差异无统计学意义(P0.05),而第4天的细胞周期检测中,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组处于S期及M期的细胞明显多于多孔n HA材料组及空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。3.MC3T3-E1细胞在与L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料共培养,经21天成骨诱导培养后,通过茜素红染色染色观察发现,肉眼观L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组的染色较多孔n HA材料组及对照组颜色更深,镜下观L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组钙结节生成的数量亦明显多于多孔n HA材料组及对照组。将复合材料表面的染料洗脱并进行定量检测,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组、多孔n HA材料组及对照组的吸光度分别为:0.37±0.04、0.22±0.01、0.19±0.03,差异有统计学意义(P0.05)。WB检测各成骨相关蛋白表达水平提示,在各观察时间点,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组各成骨蛋白表达水平高于多孔n HA材料组及对照组,且差异有统计学意义(P0.05)。4.在骨缺损模型的分析中,Micro-CT分析结果提示,在两个观察时间点,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组及多孔n HA材料组植入物周围的骨小梁体积(BV)、骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)分别为:。其中BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th四组数据中,L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组高于多孔n HA材料组,两组差异有统计学意义(P0.05)。硬组织切片染色提示两组植入物孔内均有较好的骨长入,骨与植入物界面结合紧密,但L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料组植入物孔内骨长入情况更优。结论通过上述方法成功制备多孔n HA。通过加入L-RADA16-RGD,使复合材料的生物相容性及生物活性得到了提高。L-RADA16-RGD纳米羟基磷灰石复合材料在体内外实验中均表现出良好的生物安全性、生物相容性及生物活性,具有进一步研究价值及前景。
【图文】：

统计学意义

差异有统计学意义。ab图3.1 成骨诱导前及成骨诱导后的MC3T3-E1细胞：a(×4)为成骨诱导前，b(×4)为成骨诱导后。Fig 3.1 The cellularmorphology of MC3T3-E1 cultured with DMEM/F12 (a, b) or osteogenesisinduction medium (c, d).

蛋白表达,情况,纳米羟基磷灰石,吸光值

3.3 经成骨诱导后成茜素红染色情况图 3.4 所示为茜素红染色后肉眼及显微镜下观察细胞经成骨诱导后的钙盐生成情况，即成骨细胞的矿化能力。肉眼及镜下观，L-RADA16-RGD 纳米羟基磷灰石复合材料组细胞经成骨诱导后，生成的钙结节更多，茜素红染色更明显，通过对各组染色洗脱液的吸光值测量，量化比较各组钙结节生成情况，其中L-RADA16-RGD 纳米羟基磷灰石复合材料组吸光值为 0.406 ± 0.033，空白对照组吸光值为 0.183 ± 0.026，，多孔 nHA 材料组吸光值为 0.191 ± 0.023。相比空白对照组及多孔 nHA 材料组，L-RADA16-RGD 纳米羟基磷灰石复合材料组吸光值更高，差异有统计学意义，细胞与 L-RADA16-RGD 纳米羟基磷灰石复合材料组共培养并经成骨诱导后，可生成更多钙盐，矿化能力更强。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08

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