微米羟基磷灰石—明胶丙烯酸甲酯冷冻水凝胶三维支架的制备及体内外诱导成骨性能研究

发布时间：2019-10-09 21:45

【摘要】：骨作为人体最重要的组织器官,在生命活动中承担着不可替代的作用,但是骨缺损却是临床上的常见病多发病。目前骨缺损修复方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植,异种骨移植、及假体、金属、高分子材料等人工骨替代材料等。但这些手段也都存在各自的缺陷,比如来源有限、创伤性大、排异反应,生物相容性不足、金属腐蚀性和机械性能差等等。超临界颅骨缺损受自身修复能力所限制,需要外界干预和相应的植入材料才能达到愈合的目的,如颅骨缺损。所以修补巨大和复杂的骨缺损仍是骨重建中的具有挑战性的问题,目前没有明确有效的治疗方法。因此,研究和开发能有效促进骨缺损修复的生物相容性和骨诱导性良好的生物材料和方法对临床具有非常重要的意义。组织工程是一门快速发展起来的多学科交叉再生科学,对于修复病理或损伤组织具有广阔的前景。目前已有众多研究方法进行损伤修复,比如软骨、各类硬骨骼、血管等的修复。组织工程的核心就是将细胞与生物材料相结合,建立三维空间复合体,模拟替代病变或受损组织,进行形态、结构和功能的重建以达到对缺损和创伤修复的功能。三维支架和种子细胞共培养是组织工程中最典型的培养方式。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)由于其可获得性、可扩增性和可多向分化性,成为非常理想的组织工程种子细胞来用于构建工程组织。作为一种诱导性骨祖细胞,BMSCs在骨形态发生蛋白等诱导物质作用下会向成骨细胞分化,在体外甚至没有成骨诱导剂的作用下,BMSCs在磷酸钙相关材料上也会向成骨细胞分化。近年来,以BMSCs作为种子细胞在骨缺损修复的基础和临床研究中取得了良好的效果。除了种子细胞,在组织工程骨培养方式中,作为最重要因素的支架材料,不仅为种子细胞提供三维的结构支架,使细胞在立体的环境中增殖填充,更模拟了与体内组织相似的细胞生长微环境,为细胞提供了特异性的生长和分化信号最后引导特异组织形成。一般来说三维支架应该具有合适的生物相容性,合适的降解时间和生物降解率和适当的多孔微结构等基本性能。为了满足组织或支架内氧气和营养物质能运送到细胞,废物及时排出以及血管的形成和组织增长,支架还要求具有开放的、相互连通的大孔结构。因此在生物材料领域,设计孔隙率、孔径和凝胶表面化学可控制的超大孔径的高分子材料具有非常重要的意义。水凝胶类支架由于类细胞外基质的结构仿生特性,高度的三维网络结构,有利于细胞的迁移和生长,适用于作为细胞支架或各种因子缓释的载体。为了满足生物医学应用,水凝胶被设计成类似于天然细胞外基质(ECM)的结构特点,可以为细胞提供三维(3D)支架环境,支持细胞增长和组织的形成。基于天然的生物聚合物合成的水凝胶比人工合成材料制备的水凝胶有着不可比拟的优势。近些年来,冷冻复温成胶,成为一类很有前景的用于制备组织工程支架材料的方法,叫做冷冻成胶(cryogelation),制备出的水凝胶叫做冷冻凝胶(cryogel)。利用冷冻成胶可以制备多种形态、生物相容性好的大孔径材料,并且具有开放和高渗透的多孔结构,组织弹性,和一定的机械强度,很适合溶液的扩散以及细胞、微生物、大分子物质等的转运。组织工程骨除了结构上模拟天然骨之外,在成分组成上也要尽量相似。明胶是非常便宜,来源广泛的具有很多功能基团的变性胶原蛋。与胶原相比,明胶具有更好的水溶性和低抗原性。明胶溶液本身也有独特的性能,在低温下会形成物理交联的水凝胶。此外,多种交联剂可以用来与明胶发生化学反应共价交联明胶。明胶丙烯酸甲酯(GelMA)水凝胶由于其良好的生物属性和可调的物理特性被广泛用于各种生物医学应用中。GelMA水凝胶与天然细胞外基质(ECM)有一些相似的基本性质,比如存在与细胞黏附以及基质金属蛋白酶反应的氨基酸结构单元,可以允许细胞在GelMA支架上黏附伸展及增殖。GelMA可以与纳米粒子如碳纳米管、石墨烯氧化物、羟基磷灰石等无机材料以及其他聚合物复合制成化学性质结构特点等特殊需求的生物支架网络。最近的研究证明了以GelMA为基础的水凝胶在组织工程领域被广泛的应用,包括骨、软骨、心脏和血管组织工程等。除此之外,GelMA在基础细胞研究、细胞信号传导、药物和基因传递等方面也用处广泛。骨组织由无机矿物质和有机蛋白质组成,羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)是骨的主要无机成分,人工合成羟基磷灰石因其良好的生物相容性、较强的骨传导性、诱导性、较高的化学稳定性以及与天然骨矿物质类似的生物学效应被广泛用作人工骨替代物或骨缺损植入材料或涂层。但是单纯羟基磷灰石存在脆性大、塑型难等缺陷,在组织工程应用中通常将其与高分子有机物复合制备支架材料。除此之外,羟磷灰石颗粒大小、形状、表面化学性质和其他很多因素都会影响羟磷灰石与细胞之间的相互作用,选择合适的羟基磷灰石也很重要。无机的羟基磷灰石与有机的高分子材料复合不仅可以模拟天然骨的成分组成,还可以大大增加支架材料的机械性能。将羟基磷灰石复合到冷冻凝胶中与单纯水凝胶材料优势互补,扬长避短,有望得到性能更好的生物材料。本研究的目的是开发可生物降解的具有互相贯通大孔隙基于羟基磷灰石和明胶丙烯酸甲酯(GelMA)复合材料的冷冻水凝胶,作为骨组织再生的支架。首先合成明胶丙烯酸甲酯(GelMA),然后以明胶丙烯酸甲酯(GelMA)为基础,通过添加不同浓度的微米级羟磷灰石通过冷冻成胶来制备性能不同的cryogel,并对合成的水凝胶的化学结构、溶胀比、孔隙形态、机械性能等进行表征。并进一步体外通过检测原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞在合成的含不同浓度羟基磷灰石水凝胶上的生存能力和细胞分化情况来验证了水凝胶的生物相容性和成骨诱导性能,通过体内对大鼠颅骨缺损的修复效果验证为将来的组织工程的应用提供基础。第1章大鼠骨髓间充质干细胞的分离及鉴定目的：分离大鼠下肢骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对所分离的BMSCs细胞进行鉴定,确定干细胞纯度和其成骨分化性能。方法：4周龄雄性Sprague Dawley (SD)大鼠,2只,利用全骨髓贴壁培养法,分离提取大鼠下肢骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对所分离的BMSCs细胞进行传代纯化和扩增培养。(1)显微镜下细胞的形态学观察；(2)传代培养至第4代时,应用流式细胞术对所取得的细胞进行表面标记物鉴定,包括CD44、CD45、CD34、CD90; (3) BMSCs进行成骨诱导培养,进行ALP及茜素红染色鉴定其分化性能。结果：(1)显微镜下观察,初始时BMSCs细胞呈梭形、纺锤形和多角形,后呈克隆样生长,以梭形细胞为主,胞核卵圆形,融合的细胞呈漩涡状排列。(2) BMSCs的流式细胞术检测：征性表面抗体阳性率为CD44(87.78%),CD90(98.14%)；非特征性抗体的阳性率：CD34 (0.14%), CD45 (0.06%). (3) ALP染色结果示：成骨诱导后的BMSCs染成蓝紫色,结果阳性。(4)诱导四周茜素红染色结果阳性,有矿化结节的产生。结论：(1)骨髓间充质干细胞BMSCs来源丰富、取材简单、易于培养,无伦理学限制,本实验成功提取大鼠BMSCs; (2)所分离的BMSCs形态及表型符合间充质干细胞的特征；(3)所分离的BMSCs纯度较高,可应用于本实验体外及后续动物体内实验的研究；(4)所分离的BMSCs在一定条件下具有良好的成骨分化性能。第2章微米羟基磷灰石生物特性及体外成骨效果检测目的：本实验选取了微米级羟基磷灰石,对其形貌进行了表征,并与前成骨细胞系共培养,体外探索其与细胞的生物相容性及体外成骨诱导特性。方法：本实验以选取了微米羟基磷灰石,首先分别通过扫描电镜和马尔文Zeta电位仪观测其形貌及检测表面电荷,进一步检测此mHAP体外与细胞的生物相容性及成骨诱导特性：(1)不同浓度的rnHAP (Oug ml-1、250ug ml-1、 500ug ml-1、1000ug ml-1)与前成骨细胞系(MC3T3-E1)细胞共培养,CCK-8方法检测细胞增殖活性；(2)选取了最优mHAP浓度与MC3T3-E1共培养,活死染色方法验证其生物相容性；(3)标记了FITC荧光基团的mHAP用来观察mHAP与细胞共培养的过程中的黏附作用；(4)分别用碱性磷酸酶定性染色和定量检测试剂盒检测ALP的表达情况。结果：(1)电镜下可以看到此羟基磷灰石粉末形状为微球体,表面光滑；粒径不均,约5-200微米之间,大直径的微球破坏后暴露出内部包裹着的小直径的微球；(2) FITC荧光标记的mHAP会黏附在细胞上面,与细胞之间有相互作用;(3) mHAP表面电荷为-39.84±1.37 mV(n=8)；(4)不同浓度mHAP (Oug ml-1、250ugml-1、500ugml-1、1000ug ml-1)与MC3T3-E1细胞共培养24h后,与Oug ml-1对照组相比,其他各组均促进细胞增殖(P0.01),其中500ugml-1促进作用最显著,浓度增大到1000ug ml-1促进作用有所减小；(5)活死染色结果显示,mHAP与细胞间有良好的生物相容性和黏附性；(6)碱性磷酸酶染色结果显示,不管有没有成骨诱导液存在,500ug ml-1浓度mHAP与细胞共培养能促进ALP表达分泌。结论：(1)本实验选择的羟基磷灰石为光滑的球形,直径大多接近100um,带负电荷；(2)低浓度mHAP (500ug/ml)微球具有良好的生物相容性,能促进前成骨细胞的黏附与增殖；(3)低浓度mHAP微球能促进前成骨细胞ALP分泌,有良好的成骨诱导性。第3章微米羟基磷灰-明胶丙烯酸甲酯冷冻水凝胶的制备表征及体外生物特性检测目的：以明胶(Gel)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)为原料制备了明胶-甲基丙烯酸甲酯接枝共聚物(GelMA),然后拟将无机的微米级羟基磷灰石(mHAP)与GelMA相复合,不仅可以模拟天然骨的成分组成,还可以增加支架材料的机械性能；通过冷冻成胶的方法,和添加不同质量／体积分数的mHAP制备性能不同的cryogel,并对材料进行表征,体外验证材料的生物相容性、成骨特性,为骨组织修复提供依据。方法：(1)以明胶(Gel)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)为原料制备明胶-甲基丙烯酸甲酯接枝共聚物(GelMA);(2)以3.33%浓度的GelMA为基础,复合质量／体积分数分别为0%、1%、2.5%、5%、10% mHAP,加入过硫酸铵(AP)和四甲基二乙胺(TEMED)作为交联和催化剂,并通过冷冻成胶的方法制备含不同浓度mHAP的cryogel;(3)对含不同浓度mHAP的cryogel的溶胀性能进行检测对比；(4)对不同温度下制备的含不同浓度mHAP的cryogel利用bose机检测材料的弹性模量,反应其机械强度；(5)在材料上种植BMSCs细胞,用CCK-8方法检测细胞的黏附情况；(6)选择0%、2.5%、10% mHAP的cryogel以及单纯羟基磷灰石利用傅里叶红外光谱确定材料成分；(7)对0%、2.5%、10% mHAP的cryogel通过扫面电镜对其形貌进行了表征；(8) BMSCs种植在不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上分别1天,3天,5天,利用活死染色试剂盒对细胞的活性进行检测；同时通过扫描电镜对3周时材料上细胞的生长和形态进行了观察；(9) BMSCs种植于含不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上后,分别培养3天,1周,2周之后提取RNA,实时定量PCR对成骨相关基因RUNX2、OCN和IBSP的表达进行了检测；(10)与上步骤同样的样本,培养到3周之后利用免疫荧光方法对成骨相关蛋白OCN的表达进行检测。结果：(1)以3.33%浓度的GelMA为基础,复合质量／体积分数分别为0%、1%、2.5%、5%、10% mHAP,加入过硫酸铵(AP)和四甲基二乙胺(TEMED)通过冷冻成胶的方法,均可顺利成胶,弹性良好；不含mHAP的cryogel呈透明状,含mHAP的cryogel随着mHAP含量的增多胶体越来越呈现白色；(2)溶胀率检测：不含mHAP的cryogel在前5min内具有最快的吸水速率和最大的平衡溶涨比(Qc=15.38),与其相比,复合了mHAP的cryogel吸水速率和平衡溶涨比都会减小,说明吸水能力减小,且复合的mHAP比例越多(分别为1%、2.5%、5%、10%的mHAP),平衡溶涨比数值越小(分别为9.05、8.67、5.89、5.64)；其中浓度1%和2.5%的平衡溶涨比数值接近,浓度5%、和10%的平衡溶涨比数值接近；(3)不同温度下制备的0%、2.5%、10%三个浓度的cryogel机械性能：不管是在-20℃还是在-80℃下制备的cryogel,不添加mHAP的cryogel弹性模量最低(分别是36.02±3.67kPa和7.32±1.09kPa),添加了2.5%质量／体积mHAP的cryogel弹性模量有所升高(分别为53.47±8.43和43.72±7.64),而添加到10%质量／体积mHAP的cryogel弹性模量最高(分别增加到了70.14±10.07和54.7±12.2)与不添加mHAP组比差别有统计学意义(P0.01)。不同温度下制备的同一浓度cryogel相比,-20℃成胶均比-80℃的胶弹性模量大；其中不含mHAP的cryogel -20℃与-80℃相差最大(P0.001)：(4)同一温度下制备的不同mHAP浓度的cryogel,不含mHAP的cryogel黏附率高于含2.5% mHAP的cryogel (P0.01)和含10% mHAP的cryogel (P0.01)。而同一mHAP浓度不同温度下制备的cryogel的细胞黏附率差别不大；(5)傅立叶红外光谱检测显示,含mHAP质量／体积分数为2.5%、10%的cryogel同时具备单纯GelMA和单纯HAP的特有吸收峰,只是峰值较小,说明两种材料成功复合在一起；(6)不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel的扫描电镜图片显示了其形貌,每组支架材料均呈现相互贯通的蜂窝状大孔结构,不含mHAP单纯GelMA制备的cryogl孔径大约在20-200um左右,表面光滑通透；加入2.5% mHAP孔径变化不大,mHAP颗粒包裹在胶体支架壁内,壁表面也由于加入mHAP而变的粗糙不平；当加入mHAP增加到10%时,可观察到孔径有所减小,且干燥后有坍塌的趋势,表面更加粗糙不平,可见大量块状突起,支架侧壁明显增厚；(7) BMSCs在含不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上的细胞活死染色结果显示,各组材料上细胞均活力良好,少见红色死细胞。第1天时,三组材料上的细胞均没有铺展开,细胞形态较圆,其中0% mHAP组和2.5%mHAP组黏附细胞都比较多,10% mHAP组黏附细胞相对较少；第3天时,各组材料上细胞形态发生了变化,细胞由圆形变成了伸展开的长梭形,10% mHAP组细胞依然最少；第5天时,各组细胞均增殖明显,BMSCs生长成克隆样,10% mHAP组最少；(8)BMSCs在含不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上的细胞形态扫描电镜结果：总体来说各组均有大量细胞生长,细胞基本呈长梭形,其中0%、2.5%组细胞铺满整个cryogel表面和孔隙内壁的表面,10%组细胞生长相比于其他两组较少,可观察到圆形细胞；(9) BMSCs种植于含不同质量／体积分数mHAP (0%、2.5%、10%)的cryogel上后,不同时间点3天,1周,2周后成骨相关基因表达：3天的时候,RUNX2、OCN和IBSP在各组材料上的表达都较低,但是1周和2周之后,与0%组相比,2.5%组和10%组各基因表达都有大幅度升高,其中RUNX2基因在2.5%组材料表达最高,OCN和IBSP在10%组材料上表达最高。具体如下：对于RUNX2基因,3天时,0%2.5%10%***/##,1周的时候,2.5%和10%组RUNX2表达均上升,2.5%***10%***/##0%,2周时2.5%***10%***0%；对于OCN,3天时三组相差不大,1周时10%**/#2.5%**0%,2周时,2.5%和10%组OCN表达继续升高,10%****/##2.5%****0%；对于IBSP基因,3天时10%组表达高于其他两组(P0.01),0%组和2.5%组没差别,1周和三周时2.5%和10%组IBSP表达均不断升高10%***2.5%***0%,其中2.5%和10%组差别不显著；(*代表和0%组比较,#代表和2.5%组比较)；(10) BMSCs种植在不同cryogel上3周成骨相关蛋白OCN表达结果显示,含0%和2.5% mHAP的cryogel细胞量都较多,含10% mHAP的cryogel细胞量相对较少但是成骨相关蛋白OCN的表达量确是最多,2.5%组次之,。说明添加了羟基磷灰石有促进成骨分化的功能,不含mHAP组OCN表达最少。结论：(1)以GelMA为基础,添加不同质量／体积分数的mHAP(0%、1%、2.5%、5%、10%),利用冷冻成胶的方法,成功制备出性能不同的有机无机材料复合的大孔隙率cryogel; (2)含不同浓度mHAP的cryogel溶胀率不同,添加mHAP会减小胶体的溶胀率,减小的程度与添加的量有关系；(3)含不同浓度mHAP的cryogel机械性能不同,添加mHAP可以增加胶体的弹性模量,且会温度对胶体力学性能的影响；(4) mHAP在胶体中分散均匀,随着GelMA中添加mHAP增多,胶体表面会由光滑变得粗糙,支架壁变厚,孔径减小,胶体偏向致密；(5)添加2.5%和10% mHAP的cryogel与单纯GelMA cryogel相比,会抑制细胞黏附增殖,但是相反的会促进细胞成骨分化,随着mHAP浓度越大抑制作用越明显,但是促分化作用也越明显,能明显促进成骨相关基因和蛋白RUNX2、OCN以及IBSP表达。第4章不同浓度微米羟基磷灰-明胶丙烯酸甲酯冷冻水凝胶修复大鼠颅骨缺损目的：本实验将不同浓度微米羟基磷灰-明胶丙烯酸甲酯冷冻水凝胶支架应用于修复大鼠颅骨缺损,明确其在大鼠体内的成骨效果。方法：(1)按第三部所示的方法制备不同浓度微米羟基磷灰-明胶丙烯酸甲酯冷冻水凝胶支架；(2)将以上3D支架种植于大鼠颅骨缺损部位,术后12周取材,进行大体标本的观察；(3)应用micro-CT方法对以上所有取得的样本进行扫描,明确所有样品再生骨组织的新生骨面积,对样品进行三维重建明确骨修复的情况。结果：(1)各组样品大体结果示：各组的颅骨缺损样品表面平整,已无缺损残留。(2) micro-CT检查结果示mHAP浓度为0%、2.5%、10%的GelMAcryogel均对颅骨缺损有一定的修复效果,其中以2.5% mHAP的GelMA cryogel修复面积最大效果最好(17.272~0.807mm2.***), 10% mHAP GelMA cryogel效果次之(13.036±0.948mm2**),单纯GelMA cryogel修复效果最差(10.658±1.910 mm2),证明含2.5% mHAP的cryogel具有最好的颅骨缺损修复能力。(*表示与模型组相比)结论：(1)成功造成大鼠颅骨临界骨缺损模型,空白模型组经十二周后不能自行进行骨修复,修复性能差；(2)三组含不同浓度mHAP(分别为2.5%、0%、10%)的cryogel均有不同程度的颅骨缺损修复功能,其中以2.5% mHAP水凝胶组修复面积最大,效果最好。
【图文】：

形态图,骨髓间充质干细胞,形态,融合率

后随着培养时间的增加贴壁细胞逐渐增多呈克隆样生长，并多角形细逡逑胞为主，胞核卵圆形，培养到２周左右８０％－９０％融合率，融合的细跑呈游锅状逡逑排列。细胞传代后生长迅速，大多数呈长梭形，一般２－３天能达到８０％的融合逡逑率。形态见图１－１。逡逑

表面抗体,阳性率,流式细胞术,抗体

３．２逦ＢＭＳＣｓ流式细胞术干细胞特性检n,逡逑待ＢＭＳＣｓ细胞传代纯化到第四代的时候，利用流式细胞仪检测所培养的逡逑细胞的纯度，即细胞所携带干细胞表面标记物的阳性率。结果如下图１－２：其逡逑中ＢＭＳＣｓ特征性表面抗体阳性率为ＣＤ４４邋（８７．７８％），ＣＤ９０邋（９８．１４％），非特征逡逑性抗体的阳性率为ＣＤ３４（０．１４％），ＣＤ４５（０．０６％）。逡逑１邋—邋１邋３４邋■邋ｔ；…＂。１逦，邋Ｍ逡逑W＂｜邋■忆Ｉ邋ｎ打Ｉ逦ＩＣＵＰＯ邋ｉ邋…０１邋７０６３逡逑＇．ｋＥｄ逡逑0邋，0２逦ｌ0３逦？0逦ｔｏ逦０１０逦１０逦＇邋Ｏ逦，0逡逑Ｆ邋ＩＴＣ邋Ａ逦逦＂ＴＣ邋Ａ逡逑■邋■邋－邋二邋邋邋１３４邋■■邋ｃｏ？５邋邋１邋ａａｊ邋＿ｉ３ｇ逡逑0邋，0ａ邋，0３逦，，0＊？邋，0ｓ邋ｏ邋，0ａ邋ｉｏ＊邋？0＊＊逦，0＊逡逑ＦＩＴＣ邋Ａ逦ＦＩＴＣ４逡逑图１－２邋ＢＭＳＣｓ流式细胞术鉴定逡逑检测ＢＭＳＣｓ特征性表面抗体阳性率为ＣＤ４４邋（８７．７８％），邋ＣＤ９０巧８．１４％），非特征性抗体的逡逑阳性率：ＣＤ３４（０．１４％），ＣＤ４５（０．０６％）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋目ＭＳＣｓ逡逑ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ＣＤ４４（８７．７８％）
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R687

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