黏附性人骨形态发生蛋白-2对医用钛金属材料表面的固定及其生物学基础研究

发布时间：2020-03-15 00:15

【摘要】：骨缺损的修复是骨修复医学领域所面临的难题,而骨组织工程发展为骨缺损的修复提供了新的研究方向。医用钛金属材料具有良好的机械性能和生物相容性,因此,以其作为骨组织工程支架材料的相关研究得到广泛的报道。但是,钛金属材料表面不具有生物学活性,容易导致受体骨组织从植入的钛金属材料表面脱落。所以,探索如何提高钛金属材料表面的生物学活性成为该领域亟待解决的科学问题。骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是骨形成和发生过程中重要的调控因子,并且能够诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞方向分化,进而被广泛的用于提高骨组织工程支架材料表面的生物学活性。有研究发现,3,4-L-二羟基苯丙氨酸(3,4-L-dihydroxyphenylalanine,DOPA)能够粘附在Au、Ag、Ti O2等多种金属材料表面。因此,以DOPA作为媒介,将BMP-2固定到钛金属材料表面,对于提高钛金属材料表面的生物学活性具有重要意义。本课题通过基因工程的方法将酪氨酸重复序列(Tyrosine-lysine-tyrosinelysine-tyrosine,YKYKY)整合到BMP-2的基因序列末端,并利用大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)将其进行表达;利用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)将大肠杆菌表达的蛋白质进行纯化,然后,通过酪氨酸羟化反应完成DOPA的转化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和免疫印迹等方法对蛋白质的大小、纯度和特异性进行鉴定;利用液相色谱串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)确定YKYKY中的酪氨酸是否被氧化转变为DOPA;通过圆二色光谱法(Circular dichroism spectrum,CDS)和ELISA法对蛋白质的生物学活性进行分析和检测;通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、能谱仪(Energy dispersive spectrometer,EDS)和耗散型石英晶体微天平(Quartz crystal microbalance with dissipation,QCM-D)对固化后材料的表面、碳元素特征峰和生长因子含量的改变进行分析;利用小鼠成肌细胞和人骨髓间充质干细胞与固化的钛金属材料共培养实验,测定经过固化后钛金属材料成骨诱导能力的改变;最后,通过体内实验进一步确定固化的钛金属材料表面钙元素的累积情况。实验结果表明:所构建的BMP-2-YKYKY质粒能够在E.coli中表达,且所获得的目标蛋白质经过纯化后具有较高纯度,进一步通过分子量和特异性的鉴定,确定所获得的目标蛋白质为BMP-2-YKYKY;经过羟化反应后,BMP-2-YKYKY中的3个酪氨酸均被羟化成为DOPA,同时,羟化后的蛋白质溶液仍然具有较高的纯度;通过生物学活性鉴定,发现YKYKY和DOPA的加入并没有对BMP-2的生物活性功能区的结构产生影响;并且,经过修饰的BMP-2不仅生物学活性几乎没有变化,而且具备了DOPA的粘附能力(在p H=8.5时,粘附能力最强);BMP-2-XKXKX能够显著改变钛金属材料表面的粗糙程度,提高BMP-2在钛金属材料表面的粘附量(表面的生长因子含量达到631.43ng/cm2);经过BMP-2-XKXKX修饰后的钛金属材料具有较强的成骨诱导能力,不仅能够显著促进小鼠成肌细胞(C2C12-BRE-Luc)内双荧光素酶(DualLuciferase)的表达,而且可以显著促进人骨髓间充质细胞内碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和成骨相关基因RUNX2、OSTERIX和ALP的表达,抑制干性基因OCT4、NANOG和SOX2的表达;进一步的体内实验表明,经过BMP-2-XKXKX固化的钛金属材料能够促进钙元素在材料表面积累。综上所述,本课题以DOPA作为媒介,将BMP-2固定到钛金属材料表面,探索固化后钛金属材料表面的生物学活性改变。结果提示,DOPA的引入不仅能够保持BMP-2的生物学活性,而且可以促进BMP-2在钛金属表面的粘附,提高钛金属材料表面的生物学活性,增强钛金属材料的成骨诱导能力,为钛金属材料的临床应用奠定了实验基础。
【图文】：

模拟图,模拟图,成骨细胞

图 1.1 骨重塑模拟图引自：http://www.sierrasil.com/connect/news/studies/the-role-of-minerals-in-joint-health/虽然骨表现出的性质是固体和刚性,但它实际上是一个新陈代谢活跃的组织。在成年人的骨骼,骨重塑的过程包括大多数骨代谢活动发生,这对维持骨骼结构和钙稳态是至关重要的。图 1.1 说明了骨重塑的过程，骨重塑一般有三个时期，即骨吸收期、骨逆转期和骨形成期。涉及到破骨细胞的脱骨化和脱钙化,其次未矿化的成骨细胞的形成,最终变成了矿化。骨重塑周期由三个阶段组成: ①骨吸收期,此时破骨细胞消化表面残留的老化骨；②骨逆转期,这时单个核细胞出现在骨表面；③骨形成期,成骨细胞形成与矿质化。可以发现成骨细胞是骨组织工程最为关键的细胞，成骨细胞在骨基质矿质化过程中逐渐被包被在骨陷窝中，从而成为骨细胞。成骨细胞作为重要的种子细胞，主要来源有骨膜、骨髓和骨外组织[5]。

组织工程,干细胞,间充质干细胞

图 1.2 组织工程应用的干细胞及其分化图ESC: Embryonic stem cell，胚胎干细胞; NSC: Neuronal stem cell，神经干细胞;EpSC: Epidermal stem cell，表皮干细胞; MSC: Mesenchymal stem cell，，间充质干细胞; HSC: Haematopoeitic stem cell，造血干细胞。引自：http://www.york.ac.uk/res/bonefromblood/background/MSC%20diff%20best.jpg在适宜的诱导条件下，间充质干细胞能够较为容易地分化为软骨、成骨、成肌、基质和脂肪细胞等不同种类的细胞（图 1.3）。骨髓间充质干细胞由于其分离较容易且不涉及伦理和来源问题逐渐成为骨组织工程中使用最广泛的种子细胞之一。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R68

【参考文献】