银纳米颗粒对菌膜形成及发育的浓度依赖型影响

发布时间：2020-03-21 07:40

【摘要】：由于耐药性细菌在世界范围内的广泛播散,传统类型的抗生素已经不能很好地应对因耐药菌感染而导致的公共健康威胁。在这种条件下,纳米材料作为一种新兴的抗菌物质进入了人们的视野。纳米颗粒的优势一方面在于可以通过某些特殊的靶向机制向感染部位富集,并发挥一个类似于“药物储库”的作用,在实现局部高浓度给药的同时,避免对周围正常组织的毒害。另一方面,由于纳米颗粒的抗菌性能主要是基于与细菌细胞壁的直接接触,而不需要穿透进入细胞质,因此不容易导致细菌的交叉耐药性。此外,由金属纳米颗粒释放的离子以及某些金属介导的光热效应也可以发挥杀菌作用。然而,当实际应用于临床时,纳米颗粒的抗菌效果经常会受到多方面的影响。一方面,在体内形成的混合生物膜感染往往是多种细菌共同作用的结果,而非在实验室条件下的单一培养物。另一方面,在体内的复杂条件下,纳米颗粒容易因吸附蛋白质等生物大分子而发生团聚。由此造成的有效浓度下降会诱发抗性基因的形成并最终导致治疗失败。此外,由于在体内形成的细菌感染主要发生在胞内环境中并受到宿主免疫应答的影响,在这种条件下,细菌的生长速率较为缓慢,且存在着大量处于生长停滞阶段的休眠菌,因此对外界的应激条件产生了明显的耐受性。在本论文中,我们选用经典的银纳米颗粒(AgNPs)作为一种广谱性的抗菌性纳米材料,并测试了其在不同浓度下(尤其是非致死性浓度)对菌膜形成以及细菌代谢水平的影响。主要研究内容及结果概述如下:(1)AgNPs对菌膜生长动力学的影响。我们基于经典的银氨溶液法合成了水相AgNPs,并测得其对游离铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)为2μg/mL。然而,在菌膜生长动力学实验中,我们发现在MIC浓度下生长的菌膜,其达到成熟阶段时的最大菌膜量与对照组相比不存在显著性差异,仅仅是在生长周期上发生了2个小时的滞后。一系列浓度梯度实验显示,虽然随着AgNPs浓度的增加,其菌膜的总生物量也随之下降,但是滞后期的存在以及一段时间后的恢复生长仍旧说明了细菌耐受性机制以及抗药性突变的存在。(2)AgNPs对菌膜形貌及EPS分泌效率的影响。通过对不同暴露条件下成熟菌膜的共聚焦荧光图像进行分析,我们发现虽然高浓度的AgNPs能够广泛抑制生物膜内细菌的增殖及细胞外基质(EPS)的分泌,但是当AgNPs浓度为2μg/mL或6μg/mL时,其成熟菌膜中总生物量的下降主要是由于菌膜内活细胞数目的减少,而EPS分泌量则不存在显著性差异。特别是当环境中的AgNPs浓度为2μg/mL时,成熟菌膜中EPS的分泌量甚至略高于对照组。这些实验结果说明低剂量的AgNPs暴露反而能够促进菌膜内EPS的代偿性分泌。(3)AgNPs对菌膜内组份及抗性基因形成的影响。通过对菌膜内多糖和蛋白质组份的化学定量,我们进一步明确了在不同暴露条件下菌膜内的代谢水平变化。当AgNPs浓度为2μg/mL时,菌膜内多糖和蛋白质的分泌量都高于对照组,这一点与荧光分析结果互相印证。另外,平板计数法结果显示随着AgNPs浓度的升高,菌膜内的细胞活力水平呈单调下降的趋势,也从另一个角度说明了当细菌面对不利的外界条件时,倾向于降低自身的生长速率并代偿性地分泌更多EPS以抵抗外界应激条件的冲击。
【图文】：

图 1.1 菌膜的复杂超细胞结构及其功能Figure 1.1 Complex supra-cellular architecture and its function within biofilm单颗粒追踪技术结合微流变学检测显示，该大肠杆菌生物膜的电荷密度与时间变化呈高度依赖性[16]。由于 EPS 分子填充于生物膜细菌之间的间隙，因此 EPS分子的性质直接决定了生物膜的形态和细菌生存条件，并为生物膜提供机械稳定性[17]。生物膜基质的主要成分是水（约占 97%），其它组分，例如可溶性凝胶形成多糖、蛋白质和 eDNA，以及不溶性成分如淀粉样蛋白、纤维素、菌毛和鞭毛共同参与维持基质的结构与功能[18]。最近，有研究证明，在 EPS 基质内部，微菌落之间形成的孔隙与通道有助于生物膜内的液体运输[19,20]，这说明生物膜具有一个类似于“基本循环系统”的功能[21]。在某些情况下，基质中的结构组份也可能有利于生物膜应对外界环境的变化。例如，，在大肠杆菌形成的生物膜中，基质的主要结构成分卷曲蛋白，与纤维素一起增强了生物膜对干燥的耐受性。枯草芽孢

图 1.2 生物膜内不同细菌种群间的信号传导与协作Figure 1.2 Social interactions within biofilms1.2.2 生物膜的流变学特性及其动态过程虽然机械稳定性对生物膜的存在至关重要，但生物膜本身并非刚性结构，而是一种非常粘稠的流体。位于生物膜中的细菌细胞可以在基质中移动，从而对生物膜的多孔性、机械强度和微流变学性能造成影响[17]。例如在高盐条件下的微生物组织中，经常能观察到细菌种群的垂直迁移以及不同细菌种群间的分工协作[25]。最近的观察表明，活动的浮游苏云金芽孢杆菌亚群能够以高速（20μm·sec-1）深入到生物膜结构中。穿过生物膜的浮游细菌会在生物膜基质间形成短暂的空隙，从而促进生物膜中物质的转运。也有其它的证据表明基质的部分降解可以导致生物膜的主动分散。我们通过这些观察结果得到一个共同结论：在一个较长的时间尺度上，细菌在自发形成高度有序的生物膜基质之后，还会再经历周期性的离散
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB383.1;R318.08

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本文编号：2593007