多巴胺基载纳米银生物敷料的制备及其在创面修复中作用的研究

发布时间：2020-04-01 01:06

【摘要】：研究背景大面积烧伤、创伤、静脉性溃疡和糖尿病溃疡等导致的皮肤缺损会引起严重的感染及体液丢失,给患者带来极大的痛苦及沉重的医疗负担。生物敷料能有效保护皮肤创面,提供良好的微环境促进真皮和表皮组织的再生,在创面治疗中起着至关重要的作用。因此,新型生物敷料的研发对于临床创面治疗具有重要意义。细菌感染是创面愈合的主要障碍,因此生物敷料必须具备良好的抗菌性能。纳米银(Nano silver,NS)是一种大小在1-100nm的银纳米粒子,对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有良好的杀灭效果。尤其引人注目的是,纳米银能够有效杀灭耐药菌,在全球性细菌耐药问题日益严重的情况下,其相较于传统抗生素具有独特的优势。因此,纳米银是一种可用于生物敷料制备的理想抗菌剂。但是,传统制备纳米银的方法存在操作复杂、耗能高、污染环境等缺陷。近年来,高效、环保且简单易行的仿生多巴胺表面改性技术在材料科学及生物医学领域引起了广泛关注。受到贻贝类海洋生物紧密粘附在岩石表面这一现象启发,研究者发现多巴胺(Dopamine,DA)在碱性条件下可以在材料表面发生氧化自聚合形成具有强粘附性及还原性的聚多巴胺(Polydopamine)。聚多巴胺不但可以将金属离子还原成金属单质,还能将其有效锚定在材料表面。更重要的是,研究证实聚多巴胺具有良好的生物相容性,对人体和环境无害,还有助于细胞粘附及增殖。因此,本课题第一部分研究中,我们拟应用仿生多巴胺改性技术修饰天然鸡蛋膜(Eggshell membrane,ESM)支架,制备载不同浓度纳米银鸡蛋膜生物敷料(ESM/NS)。我们预期通过细胞毒性检测优选出生物安全性良好的ESM/NS膜,并对其理化性质、抗菌活性及对创面修复的影响进行评价,以探究多巴胺改性技术修饰天然生物材料制备载纳米银生物敷料的可行性。应用于生物敷料制备的支架材料分为天然生物材料及人工合成材料。在第一部分研究中,鸡蛋膜作为天然生物材料,目前难以加工成型和批量生产,且机械性能不佳,在实际应用中受到了限制。而人工合成材料通常具有优良的机械性能,且易于加工成型和批量生产,更有望在实际中大规模应用。因此,在第二部分研究中,为进一步探究多巴胺改性技术修饰人工合成材料制备载纳米银生物敷料的可行性及临床适用性,我们拟选取人工合成支架材料——仿生的电纺聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)纳米纤维膜,应用多巴胺改性技术制备载不同浓度纳米银的聚己内酯纳米纤维膜敷料,并且对其机械性能、生物安全性、抗菌活性及在创面修复中的作用进行探讨。目的:本研究拟应用仿生多巴胺表面改性技术对天然生物材料和人工合成材料分别进行表面修饰,制备载不同浓度纳米银的生物敷料,并对其生物安全性、抗菌活性及对创面愈合的影响进行检测,以探究多巴胺表面改性技术在载纳米银敷料制备中应用的可行性。在此基础上,优选出生物安全性良好的敷料,为临床创面治疗提供新思路和新策略。第一部分多巴胺基载纳米银鸡蛋膜的制备及其对创面愈合的影响方法:1.载纳米银鸡蛋膜制备和优选1.1应用去离子水(pH=7.0)、盐酸(pH=3.0)及氢氧化钠(pH=11.0)对天然鸡蛋膜分别进行浸泡处理72小时,以提高鸡蛋膜孔隙率;用扫描电子显微镜对处理后鸡蛋膜进行观察;1.2以盐酸处理的鸡蛋膜为支架,用多巴胺进行表面修饰,利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺将不同浓度银离子原位还原成纳米银并复合在鸡蛋膜表面,制备载不同浓度纳米银鸡蛋膜(ESM/NS);1.3分离绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)转基因新生鼠成纤维细胞,将细胞接种至载不同浓度纳米银鸡蛋膜表面,通过荧光显微镜观察、扫描电子显微镜观察及MTT法检测细胞相容性,优选出无明显细胞毒性的ESM/NS膜进行后续实验;2.载纳米银鸡蛋膜的表征检测应用扫描电子显微镜、扫描透射电子显微镜、X射线能谱分析、傅里叶红外光谱仪、电感耦合等离子体光谱仪(ICP-AES)等对ESM/NS膜表征及银离子释放情况进行分析;3.载纳米银鸡蛋膜的抗菌活性检测应用纸片扩散法和细菌悬液共培养法检测ESM/NS膜对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及多重耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性;4.载纳米银鸡蛋膜对创面愈合的影响4.1载纳米银鸡蛋膜对非感染创面愈合的影响制备小鼠全层皮肤缺损模型,检测ESM/NS膜对小鼠创面愈合速率、再上皮化、肉芽组织形成、细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达的影响;4.2载纳米银鸡蛋膜对感染创面愈合的影响制备小鼠全层皮肤缺损模型并将多重耐药鲍曼不动杆菌接种于创面,检测ESM/NS膜对小鼠感染创面愈合速率、再上皮化、肉芽组织形成的影响及对体内感染细菌杀灭效果;5.载纳米银鸡蛋膜体内生物安全性检测将ESM/NS膜处理7天及28天小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器进行病理组织学分析。结果:1.去离子水、氢氧化钠及盐酸处理后鸡蛋膜孔隙率分别为42.1%,45.0%及46.1%,故选用盐酸处理后鸡蛋膜进行后续复合膜制备;载不同浓度纳米银鸡蛋膜的细胞毒性呈现纳米银浓度依赖性,纳米银浓度较低时(30μM)无明显毒性,故将其作为优选ESM/NS膜进行后续实验;2.扫描电子显微镜、扫描透射电子显微镜和傅里叶红外光谱显示ESM/NS膜整体呈现为三维纤维网状结构,表面成功负载了球形纳米银;ICP-AES测定显示ESM/NS膜载银量为3.66μg/cm~2,第1天释放银离子浓度为0.35μg/mL,释放可持续至第7天,总释放银离子浓度为0.50μg/mL;3.抗菌试验结果表明ESM/NS膜对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及多重耐药鲍曼不动杆菌具有良好抗菌活性;4.体内动物试验结果表明,ESM/NS膜能提高非感染创面PCNA分子表达水平而降低IL-1β表达水平,促进上皮细胞增殖并控制炎症反应,促进创面再上皮化及肉芽组织形成,最终加速创面愈合;造创后第7天,对照组、凡士林纱布组、ESM组、ESM/DA组及ESM/NS组的创面愈合率分别为78.3%、81.6%、81.9%、82.7%及88.6%;此外,ESM/NS膜能有效清除感染创面的多重耐药鲍曼不动杆菌,维持适宜创面组织再生的无菌微环境,加速创面再上皮化和肉芽组织形成,最终促进感染创面愈合,缩短感染创面愈合时间;5.体内生物安全性检测结果显示,ESM/NS膜处理后小鼠脏器无明显炎性病变及结构破坏等病理性损伤,提示其具有良好的体内生物安全性。第二部分多巴胺基载纳米银聚己内酯纳米纤维膜的制备及其对感染创面愈合的影响方法:1.载纳米银聚己内酯纳米纤维膜的制备及表征1.1用多巴胺对PCL纳米纤维膜进行表面修饰,利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺将不同浓度银离子原位还原成纳米银并复合在PCL表面,制备载不同浓度纳米银PCL纳米纤维膜(分别标记为:PCL/NS0.5、PCL/NS1.0及PCL/NS2.0);1.2应用扫描电子显微镜、X射线能谱分析、傅里叶红外光谱仪、水接触角测试仪、电感耦合等离子体光谱仪及机械性能测试仪对3种PCL/NS膜表征进行分析;2.载纳米银聚己内酯纳米纤维膜的抗菌活性检测应用细菌悬液共培养法检测PCL/NS膜对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及多重耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性;采用菌液吸光度测量及活/死细菌染色法对细菌杀灭效果进行评估;采用扫描电子显微镜观察PCL/NS膜对细菌生物被膜形成的影响;3.载纳米银聚己内酯纳米纤维膜的体外体内生物安全性检测3.1分离GFP转基因小鼠成纤维细胞,将细胞接种至PCL/DA及3种PCL/NS膜表面,通过荧光显微镜观察及CCK-8法检测细胞毒性;3.2分别提取PCL、PCL/DA及3种PCL/NS膜的浸提液,并应用浸提液对HaCaT细胞和NIH3T3细胞进行培养;采用CCK-8法及流式细胞凋亡检测技术检测细胞毒性;3.3将PCL/NS1.0膜处理7天及28天小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器进行病理组织学分析;4.载纳米银聚己内酯纳米纤维膜的银离子释放情况检测将PCL/NS1.0膜浸入PBS溶液中,用ICP-AES检测1、3、5及7天后PBS中银离子含量;5.载纳米银聚己内酯纳米纤维膜对感染创面愈合的影响制备小鼠全层皮肤缺损模型并将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌接种于创面,检测PCL/NS1.0膜对小鼠感染创面愈合速率、再上皮化、肉芽组织形成、PCNA及分化群31(Cluster of differentiation 31,CD31)分子表达的影响及对在体感染细菌杀灭效果。结果:1.(1)扫描电子显微镜、X射线能谱分析及傅里叶红外光谱测定结果显示PCL/NS0.5、PCL/NS1.0、PCL/NS2.0膜整体均呈现为三维纤维网状结构,表面成功负载了球形纳米银,其大小分别为73.3±33.6 nm、74.3±30.4 nm及72.2±26.3 nm;(2)ICP-AES测定结果显示PCL/NS0.5、PCL/NS1.0、PCL/NS2.0膜纳米银含量分别为1.89μg/cm~2、4.83μg/cm~2及8.31μg/cm~2;(3)ImageJ软件测量显示PCL、PCL/DA、PCL/NS0.5、PCL/NS1.0、PCL/NS2.0膜孔隙率分别为54.1%、53.5%、53.4%、53.2%及52.6%;(4)水接触角测试显示PCL、PCL/DA、PCL/NS0.5、PCL/NS1.0、PCL/NS2.0膜表面水接触角大小分别为107.9°、27.7°、25.7°、27.5°及29.2°,提示多巴胺修饰后膜表面亲水性明显改善;(5)机械性能测试结果显示,负载纳米银后PCL/NS0.5、PCL/NS1.0及PCL/NS2.0膜具有良好的机械性能,其拉伸强度分别为0.52 MPa、0.58 MPa及0.66MPa,杨氏模量分别为0.32 MPa、0.37MPa及0.39 MPa,断裂拉伸率分别为100.0%、104.4%及105.6%;2.菌液吸光度测量及活/死细菌染色观察结果提示,PCL/NS1.0和PCL/NS2.0膜对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及多重耐药鲍曼不动杆菌具有良好抗菌活性;扫描电子显微镜观察结果显示PCL/NS1.0和PCL/NS2.0膜可以有效防止细菌生物被膜的形成;3.PCL/NS0.5和PCL/NS1.0膜对接种至表面的成纤维细胞无明显细胞毒性,但PCL/NS2.0膜对表面的成纤维细胞生长有较明显抑制作用;PCL/NS0.5和PCL/NS1.0膜浸提液对HaCaT细胞和NIH3T3细胞无明显细胞毒性,但PCL/NS2.0膜浸提液会诱导细胞凋亡和坏死,导致细胞死亡,因此PCL/NS2.0膜具有明显的细胞毒性作用,而PCL/NS0.5和PCL/NS1.0膜则具有较好的细胞相容性;体内生物安全性检测结果显示PCL/NS1.0膜处理后小鼠脏器无明显炎性病变和结构破坏等病理性损伤,提示其也具有良好的体内生物安全性;4.ICP-AES测定显示PCL/NS1.0膜第1天释放银离子浓度为0.30μg/mL,第7天释放银离子浓度为0.57μg/mL;5.体内动物试验结果表明,PCL/NS1.0膜能有效清除感染创面的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌,维持适宜创面组织再生的无菌微环境,提高PCNA分子和CD31分子的表达,促进上皮细胞增殖和创面血管化,加速创面再上皮化和肉芽组织形成,最终促进感染创面愈合,缩短感染创面愈合时间。结论:1.本研究首次应用仿生多巴胺改性技术成功制备了载纳米银鸡蛋膜和载纳米银聚己内酯纳米纤维膜两种生物敷料。其制备原理是多巴胺在鸡蛋膜支架和聚己内酯纳米纤维膜支架表面自聚合形成聚多巴胺涂层,该涂层具有良好的粘附性及化学还原性,可以将银离子原位还原成纳米银并负载在材料支架表面。该制备方法操作简单、生态环保,并且能量消耗及成本均较低,易于广泛应用;2.本研究应用仿生多巴胺改性技术,不仅有效生成了纳米银,而且显著改善了聚己内酯纳米纤维膜表面的亲水性及机械性能,使其更有利于创面修复;3.本研究对制备的载不同浓度纳米银的生物敷料进行了系统的体内体外生物安全性评价,成功优选出了生物相容性良好的的载纳米银鸡蛋膜和载纳米银聚己内酯纳米纤维膜;4.本研究中优选的载纳米银鸡蛋膜和载纳米银聚己内酯纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠埃希菌(革兰氏阴性菌)及多重耐药鲍曼不动杆菌(革兰氏阴性菌)均具有优良的抗菌活性,而且能有效抑制细菌生物被膜形成。尤其是其对多重耐药鲍曼不动杆菌的良好抗菌活性表明,相较于抗生素,制备的两种载纳米银生物敷料具有独特的优势;5.本研究应用小鼠皮肤全层皮肤缺损模型,证明了优选的载纳米银鸡蛋膜和载纳米银聚己内酯纳米纤维膜能有效防止创面细菌侵袭及感染,减轻炎症反应,维持适于创面组织再生的微环境,促进感染/非感染创面上皮细胞增殖和血管化,加速创面再上皮化和肉芽组织形成,最终促进创面愈合。综合全文,我们证实了应用多巴胺改性技术制备生物安全性良好的载纳米银生物敷料的可行性,并且通过生物学研究表明这类抗菌生物敷料具备良好的体内体外抗菌活性以及促进创面愈合性能。这些成果为生物敷料的制备提供了新的思路和策略,也有望在临床创面治疗中发挥重要作用。
【图文】：

示意图,鸡蛋膜,纳米银,原位制备

（4）收取不同溶液处理的鸡蛋膜，脱水、喷金后，用扫描电子显微镜观察其表面形态。根据扫描电镜图片（每组 5 张），应用 ImageJ 软件测量各鸡蛋膜孔隙率（Porosity,P），具体计算公式为：P=1-n/N,其中，n 代表网状纤维的像素，N 代表图片总体像素。2.2.6 载不同浓度纳米银鸡蛋膜的制备制备流程如图 1 所示：（1）将盐酸处理后的鸡蛋膜浸泡于多巴胺溶液（Dopamine, DA）中, 常温下反应16 小时；（2）收取多巴胺包被的鸡蛋膜（ESM/DA），用去离子水清洗 2 次，分别浸泡于不同浓度的硝酸银溶液中（AgNO3: 50mM, 10mM, 1mM, 100μM, 50μM, 30μM, 10μM），常温避光反应 18 小时；（3）收取不同浓度硝酸银处理的鸡蛋膜，用去离子水清洗 2 次，置于恒温干燥箱中烘干，即得到载不同浓度纳米银（Nano silver, NS）的鸡蛋膜（ESM/NS）。

鸡蛋膜,溶液处理,去离子水,盐酸

图 2 经不同溶液处理 72 小时后鸡蛋膜支架的电镜照片：（A）盐酸（pH = 3.0）；（B）去离子水（pH = 7.0）；（C）氢氧化钠（pH = 11.0）2.3.2 载纳米银鸡蛋膜的细胞毒性评价及优选随后，我们应用多巴胺（Dopamine, DA）表面修饰鸡蛋膜获得了多巴胺包被的鸡蛋膜（ESM/DA），再将其浸泡于不同浓度硝酸银溶液中，，利用多巴胺自聚合形成的聚多巴胺的还原性将银离子原位还原成纳米银（Nano silver, NS）颗粒并负载在支架表面。由于纳米银对真核细胞具有潜在的细胞毒性，我们首先对这些载纳米银鸡蛋膜（ESM/NS）的细胞相容性进行了检测。如图 3A-C 所示，在成纤维细胞接种 3 天后，经浓度为50 mM, 10 mM及1 mM的硝酸银溶液处理的鸡蛋膜表面无细胞生长，而ESM（图 3I）及 ESM/DA（图 3H）膜表面则有大量细胞粘附生长，说明经这些高浓度硝酸银还原生成的纳米银具有明显细胞毒性。而随着硝酸银浓度降低，载纳米银鸡蛋膜表面生长的细胞数目则逐渐增多（图 3D-G），提示纳米银的毒性具有浓度依耐性。特
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08;R641

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