RGD修饰多孔钽对人成骨细胞增殖及COL-Ⅰ、Integrinβ1、FAK表达影响的实验研究

发布时间：2020-04-13 21:19

【摘要】：目的本研究探讨RGD多肽修饰国产多孔钽材料对MG-63细胞粘附、生长及增殖的影响,检测细胞成骨相关因子COL-I、Integrinβ1及FAK表达水平,分析国产多孔钽材料经RGD多肽修饰后的粘附生物活性,为国产多孔钽临床应用提供可靠的理论依据。方法1肉眼大体及扫描电镜下观察国产多孔钽材料的形态特征;2 MG-63细胞培养并于倒置相差显微镜下观察其的生长增殖状态;3 RGD多肽修饰活化多孔钽并制备MG-63细胞-RGD多肽多孔钽复合物。4实验分组:RGD多肽多孔钽组:RGD多肽溶液修饰国产多孔钽与MG-63细胞复合培养;多孔钽组:国产多孔钽与MG-63细胞复合培养;空白组:MG-63细胞培养;5通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察检测MG-63细胞在多孔钽支架材料上的粘附情况;6 CCK-8法检测各组MG-63细胞的生长增殖情况;7免疫细胞化学染色法检测各组MG-63细胞COLI、Integrinβ1和FAK蛋白表达情况;8 Western-blot法检测各组MG-63细胞COL-I、Integrinβ1和FAK蛋白表达情况;9实时荧光定量PCR法检测各组MG-63细胞COL-I、Integrinβ1和FAK m RNA表达情况。结果1钽支架材料大体外观为圆盘状薄片,色灰质硬,其表面粗糙不平,切面有光泽,钽支架内外均匀分布密孔,呈海绵状,小如针尖;扫描电镜下呈丰富均匀的微孔,内外孔间彼此联通呈现三维多孔结构,空间小梁呈微孔结构;2每日倒置相差显微镜下观察MG-63细胞,接种前期大部分细胞为长梭形,少量细胞成三角形及圆点状。随着培养时间延长,细胞数目增加,形态趋于一致呈长梭形或多角星状,培养后期细胞浆丰富形状饱满,彼此融合聚集呈单层细胞铺满瓶底,呈长梭形或多角星状;3 CCK-8法检测:MG-63细胞持续增殖,其OD值也随之不断升高。各时间点的RGD多肽多孔钽组MG-63细胞增殖情况与多孔钽组及空白组比较,差异均有统计学意义(P0.05),RGD多肽多孔钽组细胞增殖活性显著高于多孔钽组和空白组;多孔钽组与空白组比较,差异有统计学意义(P0.05),多孔钽组细胞增殖活性高于空白组。4扫描电镜观察结果示:随共培养时间延长,MG-63细胞逐渐附着、粘附于多孔钽支架材料表面上,进而延展伪足长入多孔钽孔隙内部,并相互连接成片,直至细胞外基质完全覆盖整个多孔钽支架。5免疫细胞化学染色结果示:第5d各组MG-63细胞胞膜、浆中均不同程度表达COL-I、Integrinβ1和FAK,呈棕黄色颗粒状。统计学分析表明RGD多肽修饰多孔钽组的Integrinβ1和FAK表达量显著高于多孔钽组及空白组,差异有统计学意义(P0.05);RGD多肽多孔钽组的COL-Ⅰ表达量高于多孔钽组及空白组,但差异无统计学意义(P0.05)。6 Western-blot检测结果示:RGD多肽修饰多孔钽组MG-63细胞中COL-I、Integrinβ1的表达量显著高于多孔钽组及空白组,差异有统计学意义(P0.05);RGD多肽多孔钽组及多孔钽组的FAK表达量略高于空白组,但差异有统计学意义(P0.05)。7实时荧光定量PCR检测结果示:RGD多肽多孔钽组与多孔钽组及空白组组间相比较,COL-Ⅰ、Integrinβ1和FAK m RNA表达量均显著上调,差异有统计学意义(P0.05);多孔钽组与空白组相比较,COL-Ⅰ、Integrinβ1和FAK m RNA表达量均显著上调,差异有统计学意义(P0.05)。结论1、国产多孔钽经RGD多肽修饰后促细胞粘附活性增加,MG-63细胞更易粘附其上;2、通过MG-63细胞膜上COL-I和Integrinβ1与多孔钽上RGD多肽结合,将细胞信号传导至细胞信号中枢FAK,激活Integrinβ1/FAK细胞信号通路,促进细胞的粘附、生长及增殖。
【图文】：

支架材料,形态结构,孔隙空间

图 1 大体观察国产多孔钽支架材料的形态结构rphology of domestic porous tantalum scaffolds was g观察多孔钽材料形态特征描电镜下可观察到丰富均匀的微孔，外部小彼此联通呈现三维多孔结构；内部整体孔隙m，孔隙空间小梁表面粗糙有光泽，内部呈微构相似。

形态结构特征,支架材料,扫描电镜观察

多孔钽材料在扫描电镜下可观察到丰富均匀的微孔，外部小孔隙直经约为～600μm，孔间彼此联通呈现三维多孔结构；内部整体孔隙联络互通，小孔约为 50～200μm，孔隙空间小梁表面粗糙有光泽，内部呈微孔结构（图 2，，与人松质骨结构相似。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

【参考文献】