PHMB修饰的人工真皮的抗菌能力检测

发布时间：2020-04-16 22:56

【摘要】：研究背景人工真皮能有效修复累及真皮层的损伤,促进创面愈合,改善愈合后功能和外观。目前临床上使用的人工真皮多为双层结构,如Intgra、Pelanc等,主要由作为生长支架的胶原层和具有屏障功能的硅胶层两层结构构成。这些人工真皮主要作用于经清创等处理彻底清除坏死组织,且未发生感染的创面,因为人工真皮移植失败的主要原因是移植后感染。移植后感染多发生于移植后早期,该时期内,由人工真皮未能与创面建立良好的血供,抗菌能力较弱,且随着创面细菌侵入、增殖,细菌分泌胶原酶,降解人工真皮的胶原层,降解产物成为细菌增殖的良好培养基,进一步增加了其移植后感染风险。移植后一旦发生感染,不但会造成移植失败,还可能引发脓毒血症,威胁患者生命。移植前彻底清创、移植后加强换药、全身使用抗生素等一系列抗菌措施应用于预防人工真皮移植后感染的问题,虽然取得了一定成效,但仍无法避免移植后感染的出现。已有大量研究将各种生长因子加入人工真皮,以期进一步促进创面愈合,借鉴于此,有研究将抗菌成分加入其中以期研制一种本身就具有一定抗菌能力的人工真皮将为改善人工真皮移植后感染问题提供新的思路和方法,也将拓展人工真皮适用范围,为创面治疗提供更多的选择。本研究选择国内Lando?双层人工真皮修复材料作为基础人工真皮,筛选合适的临床抗菌制剂,进行人工真皮的抗菌修饰,并验证其持续抗菌能力及促创面愈合的效果。第一部分:赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分选择目的:选择一种具有较强抗菌能力的抗菌制剂,作为后续研究赋予人工真皮抗菌能力的成分。方法:选择临床创面消毒常用消毒剂作为备选抗菌制剂,本研究所选择消毒剂包括:碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林。采用微量肉汤法测定创面常见细菌菌种(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌)标准菌株和临床菌株(各20株)对以上消毒剂的MIC、MBC,以消毒剂临床应用于创面的浓度作为消毒剂初始浓度,计算MIC、MBC分别为消毒剂初始浓度的稀释倍数,记为MIC_(稀释)、MBC_(稀释)。比较临床菌株和标准菌株对同一消毒剂的MIC、MBC,将MIC和/或MBC大于标准菌株的临床菌株认为是对该消毒剂敏感性降低的菌株,计算敏感性降低菌株百分比,初步判断临床菌株对各消毒剂的敏感性情况。选择具有较小MIC_(稀释)和MBC_(稀释)且临床菌株对其具有较高敏感性的消毒剂成分作为本次研究的候选抗菌制剂,用以下一阶段实验制备具有抗菌能力的人工真皮。结果:金黄色葡萄球菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀释)分别为2~(-5)、2~(-6)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-6)、2~(-1),MBC_(稀释)分别为2~(-5)、2~(-5)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-6)、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为30%、30%、55%、5%、5%、50%。鲍氏不动杆菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀释)分别为2~(-4)、2~(-4)、2~(-5)、2~(-5)、2~(-2)、2~(-1),MBC_(稀释)分别为2~(-3)、2~(-4)、2~(-4)、2~(-5)、2~(-1)、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为40%、25%、60%、10%、45%、55%。肺炎克雷伯菌对碘伏、洗必泰、新洁尔灭、PHMB、复合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀释)分别为2~(-4)、2~(-6)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-2)、2~(-1),MBC_(稀释)分别为2~(-4)、2~(-5)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-1)、-(MBC大于创面常用浓度),敏感性降低菌株百分比分别为35%、20%、40%、10%、40%、45%。结论:金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌对PHMB具有较小MIC_(稀释)、MBC_(稀释),且临床菌株对其敏感性较高,故PHMB被选择为赋予人工真皮持续抗菌能力的抗菌成分。第二部分:具有抗菌能力的人工真皮的制备及性状检测目的:以PHMB作为抗菌成分,分别采用浸泡法、微球法、夹层法处理人工真皮,检测3种方法处理后的人工真皮可持续抗菌时长,并检测相关性状。方法:将人工真皮分别进行如下处理:1.浸泡法:分别浸泡于0.1%、0.5%、1%、2%浓度PHMB溶液中24 h;2.微球法:制作直径50μm、100μm的明胶微球,每种直径明胶微球各自分别含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB,将人工真皮浸泡于上述明胶微球水溶液中24 h;3.夹层法:制作含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB的水凝胶,加入人工真皮的硅胶层和胶原层之间。分别将制备好的实验样品制成直径5mm的圆形,放置于涂抹金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株的培养皿,每天更换新的涂抹细菌的培养皿,记录每天形成得抑菌圈大小,分析各方法可持续形成有效抑菌圈时间。选择具有最长可持续形成有效抑菌圈时间且PHMB浓度较低的实验样品用于后续研究,检测性状。体外细胞毒性实验,以未加入抗菌成分的人工真皮作为对照,分别观察实验样品和未加入抗菌成分的人工真皮在第3、7、14、21 d对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率的影响。体外自然降解实验,观察在自然环境下实验样品降解情况。体内埋植实验,将实验样品埋入大鼠皮下,观察埋入部位大体反应,并记录降解情况。扫描电子显微镜观察,比较实验样品和未加入抗菌成分的人工真皮结构差异。结果:使用浸泡法制备的不同浓度的实验样品对各菌种仅在浸泡后0 d形成了有效抑菌圈;使用微球法制备的实验样品对3个菌种最长可持续形成有效抑菌圈时间均为1d,由浸泡于直径50μm、PHMB浓度为1%和2%的明胶微球溶液后形成;使用夹层法,1%和2%PHMB水凝胶加入人工真皮后对金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯菌标准菌株可持续形成有效抑菌圈时间分别为8 d、7 d、7 d。综合分析1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间可作为赋予人工真皮持续抗菌能力的方法,行下一步研究检测性状。细胞毒性实验结果显示,具有抗菌能力的人工真皮对人成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率产生影响较小,与不含抗菌成分的人工真皮比较无明显差异,P0.05。体外自然降解实验显示,1%PHMB水凝胶降解率较低,至第6周时降解率为27.388±1.943%。体内埋植实验显示,1%PHMB水凝胶埋入部位未出现明显炎症反应,切口生长较好,水凝胶至第3周降解率为23.648±2.336%。扫描电子显微镜检查结果显示,加入1%PHMB水凝胶后,人工真皮胶原层结构无明显改变,胶原层孔隙内可观察到PHMB晶体分布。结论:1%PHMB水凝胶加入人工真皮胶原层和硅胶层间,能有效赋予人工真皮较长时间持续抗菌能力,生物毒性较低,降解较慢,且不改变人工真皮胶原层原结构。第三部分:具有抗菌能力的人工真皮的在体效果验证目的:验证加入1%PHMB水凝胶的人工真皮对创面愈合的影响以及抗菌能力。方法:清洁创面移植实验:取40只SD大鼠,制备全层皮肤缺损创面模型,随机分为2个组,分别为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(Anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),各组创面分别给予不做特殊处理、覆盖人工真皮、覆盖1%PHMB水凝胶、覆盖具有抗菌能力的人工真皮,分别于第3、7、14、21 d换药,观察创面愈合及感染情况,计算每次换药时的新发感染率。换药时每组大鼠随机选取5只大鼠处死,取创面组织,分别行病理切片HE染色和CD31免疫组化,计算微血管密度(Micro-vascular Density,MVD),并行创面组织细菌定量实验。感染创面移植实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组2(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备感染创面模型,ADG2覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮。于第3、7、14、21 d换药,观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率,于21 d换药时处死所有大鼠,取创面组织行细菌定量实验。移植后持续暴露于感染环境实验:取20只SD大鼠,随机分为人工真皮组(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮组3(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每组10只,制备全层皮肤缺损创面模型,ADG覆盖人工真皮,AADG覆盖具有抗菌能力的人工真皮,每日于硅胶层外滴注1mL鲍氏不动杆菌标准菌株细菌悬液,于移植后3、6、9、12 d换药观察创面感染情况,计算每次换药时的感染率。结果:清洁创面移植实验:ADG于第7 d换药时出现1个感染创面,新发感染率均为6.67%。AADG在第3 d MVD少于ADG,P0.05,但后期AADG与ADG的微血管密度间无明显差异,P0.05。排除感染创面后,各组未感染创面细菌含量检测,第3、7、14 d AADG创面组织细菌含量明显少于ADG,P0.05。感染创面移植实验:移植于感染创面后,ADG所有创面感染症状始终无缓解,感染率持续为100%,第3 d AADG有7个创面感染症状消失,仍有3个创面感染症状在换药期间始终无明显缓解,感染率持续为30%,明显低于ADG,P0.05,第21 d取创面组织行细菌定量实验,AADG无论是未感染创面还是感染创面组织细菌含量明显低于ADG,P0.05。移植后持续暴露于感染环境实验:ADG在第6 d所有创面出现感染,AADG在第12 d所有创面出现感染,在第3、6 d两组间感染率有明显差异,P0.05。结论:具有抗菌能力的人工真皮对创面愈合影响较小,移植于感染创面后能有效控制感染,且对移植后可能导致创面感染的因素具有一定抵抗能力。
【图文】：

夹层法,真皮,人工真皮,抑菌圈

（三） 3.夹层法夹层法制备具有抗菌能力的人工真皮实验样品见图 2-1。PHMB 水凝胶透明，厚度未 1-1.5mm，质韧。将其加入人工真皮硅胶层和胶原层后，制凝胶人工真皮，褐色，半透明，3 层结构间未进行粘合，各层结构贴附尚度 PHMB 水凝胶的人工真皮在不同时间形成抑菌圈大小见表 2-5。0.1%au、aba、kpn 可持续形成有效抑菌圈时长分别为 4、3、4 d，0.5%浓度时、5 d，1%浓度时分别为 8、7、7 d，2%浓度时分别为 8、7、7 d。1%、2%释水凝胶均具有较长可持续形成有效抑菌圈时长，，为减少抗菌成分对创面凝胶选择 1%PHMB 浓度最适宜。综合比较本研究中所使用的 3 种赋予人工真皮持续抗菌能力的方法，夹人工真皮最长的可持续形成有效抑菌圈时长，其中 PHMB1%浓度与 2%浓成有效抑菌圈时长一致，故后续研究选择将 1%PHMB 水凝胶加入人工真硅胶层间作为赋予人工真皮持续抗菌能力的方法。

人真皮成纤维细胞,存活率,水凝胶,自然降解

图 2-2 人真皮成纤维细胞和人血管内皮细胞存活率（%），n=5。各时间段实验样品组合阳性对照组间均无明显差异，P＞0.05。三、体外自然降解实验实验样品主要由硅胶层、水凝胶层、胶原层三个层次组成，其中硅胶层在创面移植后覆盖期间不会出现明显降解，胶原层移植后于 2-3 w 降解[12][13]，本研究尚需明确水凝胶层的降解特性，故体外自然降解和体内埋植实验仅针对 1%PHMB 水凝胶进行。早期水凝胶吸收水分，重量增加，但真空干燥后重量下降，大部分水凝胶在降解过程中整体结构较完整，但有 2 块水凝胶出现龟裂现象。体外自然环境下水凝胶降解较缓慢，6 w 时体外自然降解率为 27.388±1.943%。体外自然降解率随时间变化见图 2-3。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318

【参考文献】