激光微孔猪脱细胞真皮基质构建及移植实验

发布时间：2020-04-19 18:04

【摘要】：第一部分激光微孔猪脱细胞真皮基质(LPADM)构建这个部分采用紫外激光贯穿形成3D矩阵的材料结合化学高渗盐脱细胞、戊二醛交联等制作过程制成了激光微孔猪脱细胞真皮(LPADM),并采用病菌学、大体、组织学及扫描电镜观察、高光谱图像智能识别分析LPADM基本特征。目的:构建激光微孔猪脱细胞真皮基质(LPADM)。方法:体质量25Kg左右健康小白猪1只,肥皂水洗刷,处死,去毛后剥取背部全层皮肤,去脂后,体积分数0.1%苯扎溴胺浸泡15min,生理盐水冲洗干净,手持电动取皮刀首先切取0.2mm厚度的刃厚皮片,去除表皮及基底膜层,然后在创面真皮组织上再切取约0.3mm厚度真皮断层皮片,分成两部分进行如下处理。(1)一部分猪真皮采用独特激光模板悬空打孔技术处理。将含有乳突层、部分网状层真皮片悬空固定在紫外激光加工设备平台上,保持皮片上下表面平整且湿润,调节设备参数为出射功率密度最小1OOOOW/mm2,微孔孔径135um,两孔间间隙lmm,经由相应孔径和孔间隙激光模板引导,在1.Ocm*1.Ocm规格区域快速击穿样品,形成100个微孔区,然后在2%NaCL、0.5%戊二醛脱去微孔化猪真皮细胞并交联,获得激光微孔猪真皮基质(LPADM)。获得的LPADM,60Co照射灭菌后制成5.0cm×5.0cm大小规格4 ℃冷藏保存。(2)另一部分猪真皮不打孔,同上脱细胞及交联制成同样规格无孔猪脱细胞真皮基质(PADM),按同样技术手段脱细胞及交联处理,4 ℃冷藏保存。对所制备的LPADM进行大体、组织学及扫描电镜观察、高光谱指纹分析。结果:LPADM、无孔PADM均柔软、有弹性,瓷白色,组织学观察显示真皮基质内未见完整细胞成分,结构未见明显紊乱,基质内细胞较为彻底干净。LPADM除了以上形态特点,还有贯穿性圆形、均一微孔结构。组织学检查显示LPADM微孔边缘激光炭化程度轻。扫描电镜示孔径中胶原纤维排列有序。LPADM的激光微孔化处理后,光谱曲线在20波段,表现为深“V”形指纹特征,组织结构呈现很大程度的特征指纹光谱图像明显差异,提示材料本身性状存在处理前后不同。结论:LPADM是一种拥有着创新的结构和结构特性的新型脱细胞真皮基质。第二部分LPADM的体外实验本实验包含两部分内容。第一部分实验:采用LPADM-Fb共培养及早期的培养液中的多种活性细胞因子检测,验证LPADM低/无毒性,良好的细胞相容性;同时论证体外预先将LPADM转变为含有成纤维细胞的LPADM作为“活性复合材料”的必要性和合理性。第二部分实验:采用间充质来源的两种干细胞BMSCs、ADSCs分别与LPADM体外共培养,验证LPADM的多种细胞相容性和作为体外干细胞培养平台的可行性,为下一步在体试验奠定基础。目的:LPADM分别与FB、BMSC、ADSCs体外共培养,验证LPADM对以上三种细胞分别在细胞毒性、细胞相容性和细胞生物学活性方面的影响。方法:分别将FB、BMSC、ADSCs与LPADM体外六孔培养板共培养,具体分为以下五步:(1)取保存备用的LPADM与无孔PADM,制备成2.0cm×2.0cm×0.3 mm大小,分别置于6孔培养皿中,用DMEM培养基中添加体积分数10%FBS制备的Fb培养液培养;取1只SD大鼠分离培养其自体皮片中的Fb,取第3代Fb部分以1 × 105个/mL密度接种于2种ADM表面,分别为LPADM-FB组与无孔PADM-FB组。(2)40倍倒置相差显微镜下观察各组Fb生长情况。接种第1、3、5天,采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定各组Fb细胞活性因子TGF-β 1、LN、VEGF、IL-6、、IL-10在492 nm波长处的吸光度值,每组每时相点6个样本,按相应试剂盒具体操作说明书进行。(3)取第3代BMSCs贴壁细胞制成细胞悬液,调整细胞浓度至I× 104个/mL,按每孔1 mL细胞悬液分别接种于2块6孔培养板,分别设3个孔为成骨组和成脂组,另分设3个孔均为阴性对照组,然后行分化鉴定。成骨组茜素红染色、成脂油红0染色,在光学显微镜下观察。(4)超净台环境中将LPADM剪成2 cm×2 cm大小放于6孔板中,微孔化真皮基质表皮面朝上。取生长良好的第三代BMSCs,胰蛋白酶消化,密度调整至4×105个/mL的细胞悬液,接种lmL的细胞悬液在六孔板LPADM的表面,放入37 ℃、5%C02饱和湿度的恒温培养箱中孵育4 h,进行第一次换液,再置于37 ℃、5%C02饱和湿度的恒温培养箱培养,每2d换液一次,体外共培养5 d。同期,重复以上操作接种一批无孔化真皮基质(PADM)。构建成BMSCs-LPADM和BMSCs-PADM两种含有BMSCs的微孔化和无孔化的真皮基质待移植材料。(5)同上,利用购买的脂肪源干细胞(ADSCs)细胞株,体外传代第三代,与ADSCs-LPADM体外共培养,观察ADSCs增殖、生长、迁移情况。结果:(1)成纤维细胞与LPADM共培养,传至第3代时,形态趋于一致,呈Fb样,生长较快;(2)接种第1、3、5天,采用双抗体夹心ABC-ELISA法在492nm波长处,测定各组Fb细胞活性因子TGF-β 1、LN、VEGF、IL-6、IL-10的吸光度值存在统计学意义(F为0.050～1.763,P0.05);(3)BM-MSCs细胞形态,成脂、成骨分化鉴定和BM-MSCs-BMSC-LPADM共生长特点。分离得到的单核细胞在倒置相差显微镜下呈圆形,折光性强。培养2d后可见部分细胞贴壁生长,呈梭状。培养5 d时,细胞已出现分裂增殖。培养12 d时细胞融合达80%,此时细胞呈现为Fb样。至第3代时,细胞形态趋于一致,为Fb样,细胞生长较快,每7天传代1次。成骨细胞诱导培养液培养3d,细胞密度增大,呈短梭形。培养5 d,细胞形态不一,部分细胞呈现为多角形。培养7 d,细胞间可见细小的钙质沉积。培养10 d,形成明显的钙结节;阴性对照组细胞密度增加,未见钙结节出现。茜素红染色,成骨组细胞可见散在的钙结节,高倍镜下呈深红色,阴性对照组无明显改变。成脂肪细胞诱导培养液培养3d,细胞中可见细小脂滴,部分细胞质反光增强,5 d后细胞质内出现小脂滴并逐渐融合,10 d后出现明显的脂滴,且含有脂滴的细胞变为圆形或多边形;阴性对照组细胞无显著变化。油红O染色,成脂组见大量含有红色脂滴的成脂肪细胞,阴性对照组未见明显改变。(4)脂肪源干细胞(ADSCs)-LPADM观察ADSCs细胞增殖活力强、生长以及细胞爬片。1-2天爬满12孔板基底。结论:经过脱细胞和激光连续微孔(气化)蛋白质源性材料的猪真皮组织后,体外与分别与成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、ADSCs体外共培养,三种细胞的生物学活性表现正常,LPADM未见明显细胞毒性作用;LPADM作为真皮替代物具有良好的细胞相容性,可为终末分化细胞--成纤维细胞、间充质来源的两种干细胞(骨髓间充质干细胞、脂肪源性干细胞)体外细胞培养提供3D生物源性平台。第三部分在体LPADM移植实验本实验包括以下五个部分。第一步采用皮下埋藏实验论证组织相容性及血管化初形成能力评测;第二步采用游离的自体皮片在体移植试验,检验LPADM形成早期血管化程度;第三步连续动态采集术区HE组织学图像,高光谱分析分析LPADM光谱特征,指纹光学特性,检评其作为移植过程血管化进程的可行性及特点;第四步LPADM-BMsc在体移植,外源性的BMsc在体观察到新生分化为皮肤附件器官的现象,提示了 LPADM作为BMsc的载体及持续促进BMsc分化定向可能具有潜在作用。第五步采用另一种人源脂肪内源性干细胞在体验证LPADM的作为多种干细胞在体移植的“载体”的稳定性和普遍适用性。目的:1、在体验证LPADM的细胞、生物相容性和血管化能力和评测;2、LPADM复合含有骨髓问充质干细胞(BMsc)的大鼠骨髓间充质细胞群的对裸鼠部分皮肤附件细胞再生修复的作用;3、验证LPADM可以为间充质干细胞提供较理想的3D生物平台。方法:(1)皮下埋藏试验。验取21只大鼠,硫化钠去毛24 h后,30 g/L戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉,对称“U”型切开脊柱两侧背部全层皮肤至深筋膜,造成2.0 cm×2.0 cm大小创面,将LPADM与无孔猪ADM剪裁成相应大小分别移植于左右两侧筋膜层上,打包固定,单笼饲养。分别于术后1、3、10 d观察大鼠的体质量变化、死亡率及皮肤有无过敏、感染征象等,同时切取深筋膜下含有LPADM与无孔猪ADM标本行组织学检查。(2)自体皮片移植试验。分为自体刃厚、自体中厚皮片逐步验证其血管化临床能力。在大鼠背部造成一个2.0 cm×2.0 cm大小的“口”型创面,深筋膜表面放置LPADM,将创区全厚皮片修薄成中厚皮片同步移植于其上,缝合、打包固定,单笼饲养。分别于术后相应观测点按随机数字表法取大鼠,观察其体质量变化、死亡率及皮肤有无过敏、感染征象等,同时切取LPADM标本行组织学检查。移植皮成活标准为早期皮片色泽红润、平坦,与受皮区基底贴附紧密。(3)将(2)中1-15天内的不同时间段LPADM标本取材,制作成HE组织切片,同步进行高光谱成像观测和分析。(4)BMsc-LPADM在体移植修复和皮肤附件新生试验。将1只SD大鼠处死.取股骨和胫骨,分离培养骨来源的骨髓间充质细胞群,取第3代贴壁细胞进行成骨、成脂肪细胞分化实验。之后将其接种于LPADM、无孔PADM上,构建骨髓间充质细胞.LPADM和骨髓间充质细胞-无孔PADM。取21只健康裸鼠随机区组分为骨髓间充质细胞-LPADM+无孔猪ADM组(简称A组,6只)、LPADM+刃厚皮片组(简称B组,6只)、骨髓间充质细胞-LPADM+刃厚皮片组(简称c组,6只)、骨髓间允质细胞-无孔猪ADM+刃厚皮片组(简称D组,3只),麻醉后在其背部正中做一 2cm×2cn,的全层皮肤缺损创面,达深筋膜,同时切取相同大小刃厚皮片备用,并分别移植相应材料覆盖创面于移植术后5、7、14 d观察裸鼠术区愈合情况及不良反应,各组分别处死1只裸鼠切取全部移植物,HE染色观察其组织结构;移植术后7、14 d透射电镜下观察相应复合物中新生皮肤附件情况。(5)LPADM+脂肪源干细胞(ADSCs)小动物活体成像试验。体外构建LPADM+ADSCs,在体移植鼠背部,左侧为实验组:LPADM+ADSCs,右侧为对照组:LPADM。术后第7、10、14d采用小动物活体成像技术观察外源性ADSCs在体活动情况:增殖合迁移。结果:(1)LPADM皮下埋藏实验。组织学检查:LPADM移植于SD大鼠背部创面后24 h,组织学检查即可观察到材料周围胶原蛋白沉积,未见新生组织及新生血管;透射电镜下观察到新生的单一结构的类血管内皮细胞。术后3d，，LPADM基质泛红明显,提拉时其与筋膜及周围组织黏附尚紧密;LPADM的HE染色可见激光打孔处新生组织生长,其中新生血管广泛存在于微孔周围和微孔内,常以含有多枚重叠红细胞征象,微孔内外炎性细胞少见。术后10 d,LPADM中血管化已呈网络状。透射电镜未见无孔ADM新生的类血管内皮细胞。术后无孔ADM组组织学观察创面中可见炎性细胞,但未见有血管形成。(2)LPADM联合刃厚皮片移植实验。1、移植术区局部观察两组动物均存活,但不同时间移植皮片的颜色外观有差别。24h的LPADM组和PADM组移植皮片均苍白,无血色明显差异,大体差异不明显;72h的LPADM组移植皮片呈现白粉基本色,其下LPADM材料明显泛红,与筋膜及周围组织黏附紧密,PADM组皮片苍白,其下PADM呈瓷白色,与筋膜及周围组织黏附一般,可轻拉下自然分离,渗出明显,多伴有异味;5天的LPADM组皮片呈现基本粉红色,PADM组皮片不同程度发黑,部分甚至出现干瘪或潮湿,异味加重,差别明显;10天LPADM组皮片呈现明显粉红色,术后14天,实验组创面移植复合皮片生长情况好,真皮基质和皮片融合,平整,缝合处未见疤痕形成。对照组皮片坏死干燥,显著差别。2、创面愈合率术后2周,复合皮片实验组完全存活,而对照组皮片大部分坏死脱落,两组创面愈合率相比,99.40%±0.24%:25.41%±1.32%。(p0.05,差异具有显著性)。3、HE组织检查结果术后24h,LPADM孔内可见白细胞浸润和渗出的纤维素,未见新生血管;术后72h,微孔内可见到新生血管,内含多个红细胞,炎性细胞少见;术后5天,LPADM处表现良好炎症反应,大量幼稚毛细血管从创面基底面向上涌向微孔处;术后10d,LPADM周围血管呈网络状,炎症细胞轻度分散。14天,LPADM周围血管化丰富,炎症反应轻微。无孔PADM,术后HE观察可见创面中大量炎性细胞,未见血管形成。4、两组ADM胶原网架中所成纤维细胞迁入及比较术后1、3天实验组创面基底新生组织涌向微孔结构,并从微孔底部向微孔内生长,取材过程中发现LPADM与创基的联合紧密,对照组较为松散,轻拉易与基底分离。术后3天,实验组显示微孔结构中有自基底向孔内涌入生长的大量新生组织,孔周边的基质中有较多的成纤维细胞形成的大量新胶原迁入。对照组的未打孔的基质胶原网偶见成纤维细胞散在的迁入现象。5、电镜观察结果术后3天的扫描电镜显示,实验组基底的基质组织和新生肉芽组织通过孔径结构沿着孔径内部从基底垂直向上涌向LPADM胶原网架中形成新基质生长,新生组织内小血管的生长旺盛',为基质胶原网架中迁入的成纤维细胞的生长、增殖、分裂及分泌活动提供了良好的基质新生微环境。术后14天的透射电镜显示,实验组虽然LPADM中有及少量的炎症细胞的迁入,迁入基质网架的成纤维细胞电镜下核大呈不规则形、分裂旺盛,粗面内质网布满细胞液中。对照组的PADM新生组织的难以长入,迁入的成纤维细胞极少,炎症细胞为主。(3)LPADM联合中厚皮片移植实验。1、大体观察移植后14 d自体中厚皮片成活。30 d即可提捏术区皮肤,皮肤愈合质量良好。经复合移植的大鼠均存活,未见明显局部和全身过敏反应,其日常行为无异常,体质量正常增加。2、移植术区局部观察两组动物均存活,但移植皮片的不同时间颜色外观有明显差别。24h的LPADM组和PADM组皮片均苍白,无血色,二组无大体明显差异;72h的LPADM组皮片呈现基本粉红色,其下LPADM材料明显泛红,与筋膜及周围组织黏附紧密,PADM组皮片苍白,其下PADM呈瓷白色,与筋膜及周围组织黏附一般,可轻拉下自然分离,渗出明显,多伴有异味;5天的LPADM组皮片呈现粉红色,PADM组皮片不同程度发黑,部分甚至出现干瘪或潮湿,异味加重,差别明显;10天、14天的LPADM组皮片呈现明显粉红色,PADM组皮片发黑完全,干瘪或潮湿,流脓,差别显著。3、HE组织检查结果术后24h,LPADM孔内可见白细胞浸润和渗出的纤维素,未见新生血管;术后72h,微孔内可见到新生血管,内含多个红细胞,炎性细胞少见;术后5天,LPADM处表现良好炎症反应,大量幼稚毛细血管从创面基底面向上涌向微孔处;术后10 d，LPADM周围血管呈网络状,炎症反应良好,激光微孔孔内壁处颜色和孔周围ADM相融,蓝色变性组织弱化。14天，LPADM周围血管化丰富,炎症反应良好,激光微孔孔内壁处颜色淡化和孔周围ADM更相融表现。无孔PADM,术后HE观察可见创面中大量炎性细胞,未见血管形成。(3)连续HE标本动态高光谱分析。1、激光微孔LPADM材料高光谱分析与没有参与动物在体实验的LPADM全波段光谱(即0天LPADM,黑色曲线)对照,在体动物实验的LPADM绿色曲线在横轴20波段,均呈现出相应深“V”形特征,但随着时间1-15天,LPADM孔壁内测局部结构的光谱,纵轴的亮度值逐渐变大,由LPADM的1500附近(0天)到3000附近(15天),说明,随着组织相相容性、炎症性、孔内壁坏死组织吸收后改善,透光度也相应提升;2、LPADM移植后,微孔内红细胞高光谱分析与正常皮肤内的成熟红细胞全波段光谱(黑色曲线)对照,LPADM红色曲线在特征位于10、25、40附近波段,均呈现出相应“V”形特征,与成熟的红细胞光谱曲线差异较大,但随着时间增加,新生血管中的红细胞光谱曲线逐渐与正常成熟红细胞的光谱曲线相吻合,如,第3天,就10波段的亮度值已达到3600，接近正常的3800;第10天,就10波段的亮度值已达到正常的3800;说明第3天LPADM新生血管生理活力已接近正常成熟皮肤血管;3、LPADM移植后,微孔内和微孔周围炎症细胞高光谱分析相同时间段,微孔内炎症细胞(绿色曲线)和周围的炎症细胞(蓝色曲线)光谱相对比,两条曲线在横轴20波段,均呈现出相应深“V”形特征,两者差异不大,随着时间增加,炎症细胞光度值也未有过明显起伏表现,说明经过激光贯穿、化学脱细胞处理均未对大鼠免疫系统产生应激和影响大鼠创面正常的修复。(4)BMsc-LPADM在体移植试验。1、LPADM、无孔猪ADM呈瓷白色,柔软、有弹性,组织学观察显示真皮基质未见细胞成分;扫描电镜示孔径中胶原纤维排列有序;LPADM还有微孔结构。2、细胞传至第3代时,形态趋于一致,呈Fb样,生长较快。3、诱导分化实验表明,细胞可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。4、移植术后5 d，A组无孔猪ADM局部干燥,D组皮片局部干燥坏死,A、D组均未见感染及炎症反应;B、C组移植皮片成活。移植术后7、14 d，A组表面的覆盖物局部色泽发黑,干燥发硬;D组皮片出现完全变黑下燥坏死,皮下可见淡黄色清亮渗液;A、D组均未见明显脓性分泌物。B、C组皮片外观与周围皮肤颜色接近;5、移植术后5、7 d，A、B、C组真皮基质的微孔结构中已见血管化,其内可见有形红细胞;D组移植皮片部分干燥坏死。移植术后14 d,A、B、c组真皮基质的微孔结构中己完全血管化,其内可见大量的红细胞,纵切片中,A组微孔真皮基质成活,但与其上所覆盖的无孔猪ADM未紧密结合;B、c组皮片与真皮基质问连接紧密,皮片中均未见皮肤附属器,c组创面皮片与真皮基质交接处可见特殊的单层细胞;6、D组移植皮片未能成活,故放弃电镜观察。移植术后7 d,A、B、c组透射电镜图片未见明显差别:移植术后14d，A、B组移植物中未见皮脂腺样及汗腺样细胞,也未见新生神经末梢,仅见Fb迁入,c组创面刃厚皮与真皮基质交接处可见大量新生毛细血管增生,Fb粗面内质网分裂增殖旺盛,可见新生的无髓神经末梢;在真皮基质浅层,出现单个游离的皮脂腺样及汗腺样细胞。(5)LPADM+脂肪源干细胞(ADSCs)小动物活体成像试验。在体移植鼠背部,左侧为实验组:PADM+ADSCs,右侧为对照组:LPADM+ADSCs。小鼠单笼饲养7、10、14d后,带至活体成像室。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,每只注射0.2mL。在小动物成像仪中成像(小动物活体成像仪为IVIS LuminaII),并记录。观察到荧光显示,并向创伤区没有干细胞铺被区增殖和迁移。结论:LPADM是一种具有低免疫原性、早期稳定血管化能力的一种新型真皮替代物,高光谱分析提出其特征性指纹光谱可供血管化快速鉴定,指纹特征光谱可以作为识别标志物;LPADM有助于促进细胞修复,甚至修复皮肤附件器官新生。
【图文】：

光谱曲线,真皮,光谱曲线

图４逦（ａ）正常真皮邋（ｂ）邋ＬＰＡＤＭ、ＰＡＤＭ邋（ｃ）光谱曲线逡逑

电镜观察,扫描电镜

图３邋ａ邋ＳＥＭ逦圈３邋ｂ邋ＳＥＭ逡逑ＬＰＡＤＭｔｊ描电镜观察：Ｋ原纤维结构完整、连续？末见断裂且排列有序
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318

【相似文献】