载酶人造细胞的构建及其对肝癌细胞的作用

发布时间：2020-04-24 05:26

【摘要】：尽管细胞生物学的知识一直在更新进步,但人们对细胞的整体结构和功能仍未完全了解,即便是自然界中最简单的活细胞,其结构和功能也极为复杂,而人造细胞的出现为细胞结构和功能的探索指引了新的方向。在过去的几十年里,人造细胞的研究在细胞生物学、分子生物学、超分子化学和生物医学等领域取得了令人瞩目的成就。由于磷脂组装体与细胞结构的相似性,聚合物载体本身的机械稳定性、化学多功能性和可生物降解性,将磷脂组装体和聚合物载体作为人造细胞模型在仿生领域的研究已日益成为人们关注的焦点。然而目前人造细胞的构建方法在很多方面还不够完善,与真实的生物细胞相比,人造细胞还过于简单,无法对复杂的细胞结构和功能进行模拟。另外,目前也鲜有研究细胞器之间相互作用的报道,且生理环境下人造细胞的应用和人造细胞与生物细胞的相互作用也有待探索。因此,针对这些问题,本文通过不同的方式构建了人造细胞并开展了系统的研究。以细胞膜的基本组分1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)为原料,利用点面电极产生的非均匀电场同时制备磷脂微管和巨型磷脂囊泡(giant unilamellar vesicle,GUV)。利用COMSOL软件分析了产生这种现象的潜在原因,电场产生的临界力Fc和流体场的侧向流动引起的牵引力F起主要作用,当Fc小于F时,形成磷脂微管;当Fc大于F时,则形成GUV。另外还从理论模拟上研究了电极间距对生成GUV和磷脂微管比率(GT ratio)的影响,并用实验进行了验证,结果显示电极间距越大,生成磷脂囊泡的比率越大。结合微接触剥离技术和电形成方法,利用点面电极与聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)印章可制备出附着于基底的GUV阵列。GUV的尺寸与剥离步骤所用的PDMS印章特征尺寸相近,通过PDMS印章的尺寸可以控制GUV阵列的尺寸,20、50和85μm的印章制备出的GUV直径分别为27.87±2.22μm、64.06±3.08μm和82.25±5.76μm。不同种类的单元磷脂或三元混合磷脂都可以制备GUV阵列,其中DOPC GUV阵列效果最好,可作为细胞模型进行后续研究。GUV阵列可作为封装DNA等生物分子、研究物质的跨膜运输和模拟细胞代谢的良好平台。GUV内羧基荧光素CF的扩散程度受蜂毒素浓度的影响,当蜂毒素浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μM时,CF的扩散系数(D)分别为0.37×10~(-11)、0.36×10~(-11)、0.54×10~(-11)、1.10×10~(-11)、1.74×10~(-11)、2.31×10~(-11)、3.62×10~(-11) m~2/s。将辣根过氧化物酶(HRP)负载于GUV阵列中被用于模拟细胞代谢,底物H_2O_2和o-PD成功地扩散至GUV内部发生反应,产生了荧光物质2,3-二氨基吩嗪(2,3-DAP)。受真核细胞区室化结构启发,基于海藻酸盐构建了同时含有载酶脂质体(L_(Cat))和真实细胞核(pNuc)的多室人造细胞,其中pNuc来源于RAW 264.7细胞,可合成mRNA,而L_(Cat)可模拟细胞器,能够将过氧化氢(H_2O_2)转化为氧气和水。与不存在H_2O_2或不含L_(Cat)的人造细胞相比,含有天然pNuc和合成L_(Cat)的人造细胞在H_2O_2存在下可产生更多的mRNA,说明局部酶反应产生的O_2可促进mRNA的合成。这种含有天然和人工细胞器的新型人造细胞的设计为缺氧细胞模型的制备或无细胞的蛋白质合成提供了机会。利用微接触印刷(μCP)技术制备了P1粒子阵列,评价了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和HepG2肝癌细胞在图案化基底上的黏附和增殖行为。HUVEC细胞在P1粒子阵列上的黏附取决于P1附着于基底的稳定性,若P1附着于基底的稳定性较弱,则HUVEC会取代P1黏附在整个基底并发生增殖,若P1附着于基底的稳定性足够强,细胞在无粒子存在的区域黏附;而HepG2肝癌细胞在P1阵列上没有空间选择性,48 h内细胞在此图案化基底上均匀黏附和增殖且不会破坏粒子阵列。利用层层组装技术,用聚合物涂层把葡萄糖氧化酶负载的脂质体(L_(GOx))固定到SiO_2粒子上,构建出复杂的多室人造细胞,同样应用μCP技术制备人造细胞阵列,溶液中和阵列上人造细胞的活性直接取决于制备过程中组装L_(GOx)的用量。最后,将载酶人造细胞阵列与HepG2肝癌细胞共培养,由于在底物葡萄糖存在的情况下,局部产生的H_2O_2可杀死肝癌细胞,因此与在无酶阵列中黏附的细胞相比,载酶人造细胞阵列作用下的HepG2肝癌细胞表现出更高的细胞死亡率。该结果对复杂多室人造细胞的设计与构建提供了重要指导,在细胞治疗领域具有潜在的应用价值。
【图文】：

显微镜,细胞,人造细胞,原始细胞

图 1-1 Robert Hooke 自制的简陋显微镜及观察到的细胞[6]ig. 1-1 Discovery of cell using home-made microscope by Robert Hook对生命体的组成具有重要意义。原始细胞经历亿万年来的进功能上如此复杂而完美的现代细胞，但原始细胞从何而来，决这些长期存在的谜团具有深远的意义。即使对生命起源的也将有助于弥合非生命和生命形式物质之间的沟壑，有助于论的统一。所述，尽管细胞生物学的知识一直在更新进步，但人们对细能仍未完全了解，即便是最简单的活细胞，其结构和功能也极降低活细胞的复杂性并克服活细胞脆弱性的问题，科学家们系中研究细胞的结构和功能特性、细胞的动态活动、细胞间生命的起源，因此稳定且易控制的人造细胞的构建十分必要年，Chang 等人首次提出了人造细胞的概念[13, 14]，并引起学20 世纪 70 年代，研究人员将酶、蛋白质和激素引入可生物并用于 Lesch-Nyhan 综合征等疾病的治疗中[15, 16]。20 世纪[17, 18]

人造细胞,基本组成,尺寸,生物细胞

图 1-2 人造细胞的基本组成和尺寸[37]Fig. 1-2 Basic compositions and dimensions of artificial cells[37细胞的构建胞的构建是合成生物学的支柱之一[38]。理想的典型人造似的结构或表现出一些生物细胞的基本特性[39-41]，，构建“活着”的人造细胞[32]。一般来说，“活着”就意味着复制和自我更新。活细胞本身在结构和功能上的复杂性胞的构建变得极为艰巨且极具挑战性。生物细胞具有三的基本功能[1]：（i）稳定的半透膜，包裹细胞成分，维内物质免受胞外环境的破坏，同时又能调节物质选择传信息生物大分子（DNA 或 RNA），控制细胞的动态与进化的能力；（iii）一系列代谢途径，为细胞提供能量持自我更新。科学家们非常希望人造细胞具有生物细胞- 5 -
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318

【参考文献】