矿化细胞外基质—细胞微球（MECS）引导骨组织再生的研究

发布时间：2020-04-24 20:13

【摘要】：研究背景:骨缺损的修复是临床上亟待解决的问题之一,现阶段骨缺损的治疗方法主要有:自体骨移植,异体骨移植以及人工合成替代物移植等。然而自体骨和异体骨移植因来源和排异反应等问题,应用受到了很大限制。因此人工合成骨替代物一直是组织工程和再生领域研究的热点。骨在体内是由成骨细胞与成骨细胞分泌的细胞外基质(ECM)中的矿化胶原纤维后作为骨的基本结构,进一步螺旋排布形成复杂的骨。矿化胶原纤维和成骨细胞一直是骨再生领域中研究者们关注的热点。然而细胞的体外培养大部分是在二维空间培养,培养时细胞表面与二维培养皿接触,导致细胞微环境发生变化,改变了细胞干性的表达。为保存完整的细胞微环境,对细胞进行三维培养是近来的研究方向之一。体外支架材料如β-TCP以及矿化胶原材料都无法真实模拟出骨细胞的自然分泌形成过程。因此我们试图在体外模拟骨的形成过程,构建出一个由细胞和自分泌的矿化细胞外基质作为基本结构的细胞微球,进一步探讨所构建出微球的性能变化。研究目的:合成具有三维空间结构的细胞自分泌及组装的细胞微球(Cell Spheroid,CS)。模拟体内骨的矿化过程,在体外对具有三维结构的细胞微球进行矿化诱导;得到类似于骨基本结构,由细胞自分泌的矿化基质和细胞共同组成的复合物—矿化细胞外基质细胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。探讨MECS的成骨能力,以及在骨缺损区域的修复效果。探讨MECS作为骨再生移植物的优势与不足。方法:体外通过三维微孔培养板接种大鼠骨髓间充质干细胞后通过将Ca~(2+)、PO_4~(3-)离子的加入,获得细胞微球(Cell Spheroid,CS)、矿化细胞外基质的细胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。体外通过扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)对微球的形貌、成分、力学性能进行分析。Live/dead assay(活/死细胞检测)进行微球中细胞状态进行检测。激光共聚焦显微镜来观察细胞微丝骨架(F-actin)、细胞核(DAPI)以及细胞分布。体外通过Real-time PCR检测CS与MECS细胞中成骨相关基因ALP、BMP-2的表达差异;体内移植后应用Micro-CT,组织学染色来观察CS和MECS是否在骨再生领域有良好的应用,是否拥有组织工程再生材料的三大特性:骨引导、骨诱导和成骨性。结果:在研究中,我们成功合成CS和MECS两种细胞微球,经检测,MECS细胞外基质中有纳米羟基磷灰石的分布,其力学性能远优于CS,细胞含量以及直径尺寸上也优于CS。通过体外PCR检测基因表达情况,我们发现MECS的成骨相关基因ALP、BMP-2的表达量较CS增高,在裸鼠实验中,也与体外PCR检测相一致,MECS的体内有骨样结构生成。在骨缺损区域修复的应用中,Micro-CT显示:骨缺损区域已由MECS的新生骨填满,从组织学染色分析,MECS新生骨区域包含成熟骨组织以及丰富的血管结构。结论:1.成功在体外通过自组装的形式合成具有三维矿化细胞外基质的细胞微球。2.细胞外基质中的纳米羟基磷灰石提高了细胞微球的强度和支撑能力,有利于细胞的增殖和分化。3.在体内和体外,MECS都展现出良好的成骨能力以及血管化能力和骨再生、修复效果。为组织工程和骨再生提供了一个新的思路。
【图文】：

7图1 骨的九层结构基质囊泡中的碱性磷酸酶切割磷酸酯并作为钙和磷酸盐沉积的焦点，这一过程有量的非胶原蛋白（NCP）参与[104-106]。无机和有机相的纳米级精确排列形成了一个适应性强的功能性生物材料。像许多矿化组织一样，从纳米结构到宏观，，骨由各种形变和韧化机制增强其抗断裂能力[107]。作为肌肉-骨骼运动的主要机械支持物，骨骼在整个生命周期中的有效重塑，有利于维持哺乳动物机体骨骼组织的完整性。天然骨主要组成结构从纳米到宏观分为几个层次[100]，皮质骨和骨小梁的外部几何形状和内部结构代表了骨的宏观和微观结构水平。皮质骨包括哈弗斯小管和细胞。胶原蛋白和羟基磷灰石矿化物作为矿化胶原纤维的主要成分，进一步通过空间结构的组装形成纤维， 为天然骨骼提供卓越的机械性能和重塑能力。Weiner和Wagner首先提出了层状骨组织中的7个层次[108]。考虑到有序和无序成分的存在

基和矿化培养基，连续培养 5d。5) 显微镜下观察细胞球生长情况。图1.1 微孔细胞培养板示意图表 1.2 矿化 A 液培养基成分 终浓度 品牌α-MEM 培养基 GIBCO胎牛血清 20% GIBCO青霉素/链霉素 100U/ml BIOSOURCE谷氨酰胺 2mM BIOSOURCE2-甲氧基雌二醇 55uM GIBCO地塞米松磷酸钠 55 μM SigmaK2HPO44.2mM 北京化学试剂厂
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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本文编号：2639354