DMOG复合煅烧骨支架修复骨缺损的实验研究

发布时间：2020-05-05 19:02

【摘要】：目的本实验将二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxallyl glycine,DMOG)、I型胶原、煅烧骨(true bone ceramic,TBC)制备成负载DMOG的I型胶原(Collagen Type I,COL I)煅烧骨复合支架材料。研究复合支架材料的表征,并在细胞水平和动物水平评价复合支架材料的成骨活性和骨修复能力。方法1、分离SD大鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)并在体外培养。2、通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测DMOG对BMSC成骨分化的影响。3、分别制备单纯TBC支架、COL I/TBC支架、DMOG/COL I/TBC支架,并对其表征进行分析,包括X射线光电子能谱(X-ray diffraction,XRD)、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)及DMOG在复合材料中的释放曲线。4、各组支架材料经~(60)Co辐照灭菌后与骨髓间充质干细胞共培养评估其相容性。5、通过RT-PCR检测各组支架材料对BMSC成骨分化及促血管新生的能力。6、随机选取30只新西兰大白兔,建立股骨髁骨缺损模型,分为四组,分别为:空白对照组;单纯TBC支架组;COL I/TBC支架组;DMOG/COL I/TBC支架组。于术后12W取材,行骨组织病理分析、骨形态计量测定及免疫组化评估新骨生成情况及分子机制。结果1、原代BMSC细胞培养72h后成多角梭形,均匀分布,第8d形成集落并达85%融合。2、ALP染色结果显示:试验组ALP染色比对照组颜色深,且200μM DMOG实验组比50μM DMOG实验组ALP染色颜色更深,三组颜色差异明显,DMOG能显著地提高BMSC细胞的成骨分化能力。3、XRD图谱显示:TBC支架材料主要成分为羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2),DMOG/COL I/TBC支架中含有DMOG分子。4、SEM扫描发现BMSC细胞在TBC、COL I/TBC、DMOG/COL I/TBC支架材料表面均生长良好,BMSC细胞呈长梭形,BMSC细胞数量较多,连接成片且各组间无明显差异,BMSC细胞与DMOG/COL I/TBC支架材料生物相容性较好。5、DMOG/COL I/TBC支架材料与BMSC细胞共培养后ALP、OCN、VEGF、Runx2的mRNA表达量明显高于COL I/TBC支架材料组、TBC支架材料组。负载DMOG后的COL I/TBC复合支架材料对BMSC成骨分化及促血管新生的能力显著提高。6、释放曲线提示:DMOG在复合支架材料中没有出现爆释,在7天后仍有一定含量的DMOG释放,且呈继续缓慢释放趋势。7、骨组织病理分析、骨形态计量测定提示:空白组中几乎无新生骨,TBC、COLI/TBC组均有少量新骨且新生骨主要集中在支架边缘,两组差异不明显,而DMOG/COL I/TBC组新骨明显多于其它组且支架中心的新生骨较多。高倍镜下可见DMOG/COL I/TBC组新生较多毛细血管,而COL I/TBC组中较少。8、免疫组化染色提示:COL I/TBC组Runx2和CD31少量表达,而DMOG/COL I/TBC组中Runx2和CD31表达较多。结论本实验表明DMOG能有效促进BMSC细胞成骨分化,实验制备的复合DMOG/COL I/TBC支架材料与BMSC细胞有很好的相容性,DMOG负载至COL I/TBC支架材料能实现缓慢释放,DMOG/COL I/TBC支架材料能有效促进兔股骨髁骨缺损的修复。
【图文】：

图 2 各组煅烧骨支架的 XRD 分析的结果注： XRD 分析结果显示在 11°左右搭载 DMOG 的胶原涂层煅烧骨有一特征（三）DMOG/ColI/TBC 复合支架材料释放 DMOG 的特征1、煅烧骨与 50mg/ml COL I 醋酸和 4M DMOG 溶液浸泡 48h 后24h、48h、72h、96 h 、120 h 、144 h 、168h 后检测释放液中 DMO在实验的第一天累计释放约为 60%的 DMOG，主要是释放物理吸附部后是一个较长时间的缓慢释放，在我们观察的 7 天内，均可见 DDMOG/ColI/TBC 复合支架中缓慢释放。

图 3 DMOG/COLI/TBC 支架材料中 DMOG 的缓释曲线二、DMOG/COL I/TBC 支架材料对 BMSC 成骨分化的影响（一）SD 原代 BMSC 细胞的分离与培养按实验中方法分离 6 月龄 SD 大鼠的 BMSC 细胞。可见原代 BMSC 细养 72h 后成多角梭形、但分布不均。第 3 代 SD 大鼠的 BMSC 细胞形态较呈纤维样。培养至第 5 代时，，BMSC 细胞形态和状态均不佳。故本研究选代 BMSCs 用于细胞的黏附和成骨分化实验。P0 P3 P5
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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本文编号：2650613