基于超亮共轭聚合物纳米粒子的数字式生物检测方法的构建

发布时间：2020-05-09 08:06

【摘要】：数字式生物检测方法由于灵敏度高、能实现目标分子的绝对计数,近年来成为体外诊断领域的重要发展方向。目前的数字式生物检测方法(数字PCR和数字ELISA)主要通过物理隔离的方式将目标待测生物分子限制在较小空间以提高单位体积的待测分子浓度,从而实现单分子检测的目的。然而,物理隔离方法(如微阵列芯片和微液滴)增加了检测体系的复杂度以及芯片制造成本,另外生物检测结果的重现性控制难度也大幅提高。因此,本文采用超亮共轭聚合物纳米粒子作为信号标记材料,旨在建立一个基于微球的不需额外物理分隔的数字式生物检测方法。首先,制备超亮共轭聚合物纳米颗粒并作为生物检测信号标记单元。通过共轭聚合物PFBT与梳状两亲性聚合物PS-PEG-COOH共沉淀制备一系列不同粒径的共轭聚合物纳米粒子(CPNs),并探究其荧光性质随粒径的变化规律。研究结果表明,随粒径增大,CPNs能保持稳定、优异的光学性质,其单颗粒荧光强度随粒径的平方线性增长。粒径为140 nm的CPNs能达到激光共聚焦显微镜的检测限且粒径相对较小,优选并确定为本研究的信号标记材料。其次,建立基于微球的数字式生物检测模式平台。分别在微球和共轭聚合物纳米粒子上修饰链霉亲和素(SA)和生物素,得到偶联SA的微球(微球-SA)和生物素化的CPNs(CPNs-biotin)。将CPNs-biotin以一定比例加入到微球-SA反应体系中进行亲和反应,由于添加的CPNs-biotin数目远低于微球-SA数目,确保了每个微球表面结合的CPNs-biotin至多1个。随后,通过激光共聚焦显微镜检测每个微球上的CPNs的荧光信号,结合CPNs-biotin的微球作为信号“1”,未结合CPNs-biotin的微球作为信号“0”,统计连接有CPNs荧光的微球数占总微球数的比例,通过泊松分布计算投入CPNs-biotin浓度,由此实现数字式生物检测。实验结果发现结合到微球上的CPNs-biotin数目服从泊松分布,且模拟生物检测的检测限达到18 aM,因此从原理上验证了本文提出的基于微珠的数字式生物检测方法的可行性。最后,本文以人绒毛膜促性腺激素(hCG)为待测蛋白目标分子,分别将捕获抗体和标记抗体偶联在微球和CPNs表面,并以微球为反应载体,同时以CPNs为检测信号单元,建立了微球基三明治夹心数字式生物检测方法(Beads-Digital ELISA),并初步探究了该方法的可行性。综上,本文建立的基于微球的数字式生物检测方法具有超高的检测灵敏度,在体外检测领域有巨大的应用潜力。
【图文】：

分布图,纳米粒子粒径,标尺,染料掺杂

解控二氧化硅纳米粒子的 TEM 图像，标尺 100的纳米粒子粒径分布图。[16]ive TEM images showing the mesoporous structur (b) Particle size distribution obtained with the DL[17, 18]另辟蹊径，，利用常用荧光染料罗丹米粒子，再通过熟化形成纳米粒子的团个染料掺杂的纳米粒子粒径在 3 nm 左右。根据图 1- 2 (b)，所合成的染料掺杂的罗丹明 6G 的 212 倍，是 30 nm CdSe@, 14]将荧光分子 BODIPY 与苯乙烯在大行 RAFT 聚合，合成了粒径为 70 nm 的荧光强度是量子点的 200-2000 倍。

示意图,量子点,配体,过程

图 1- 3 CdTe/CdS/ZnS 量子点配体转换的过程示意图。[22]Fig. 1-3 Reaction scheme of CdTe/CdS/ZnS QDs ligand exchange.了获得更高荧光强度的量子点，Sheng 等人[27]将 CdSe 量子点制成纳米簇 CdSe 量子点表面修饰生物素，再向体系中加入链霉亲和素，由于一个链能与 4 个生物素反应，所以链霉亲和素能将修饰生物素的不同量子点团，形成 86 nm 左右的纳米簇，最后通过 SA 和生物素的亲和反应修饰上胞的适配体，用于癌细胞的检测。与单颗粒量子点相比，这种量子点纳光检测信号高出了 14 倍。有研究者将量子点装载到氧化硅小球，使得纳米粒子上富集量子点，极颗粒的荧光强度。如图 1- 4 所示，Qian 等人[28]和 Wu 等人[29]将量子点通联结合在氧化硅小球表面，粒径为 100 nm 左右，在其上修饰二抗作为信料通过电化学发光法进行免疫检测，使检测信号得到 6.6 倍的放大。外，Ranzoni等研究人员[27]通过溶胀法将量子点掺杂到PS球中，形成200 “番木瓜粒子”（如图 1- 5 所示），其中装载了约 10000 个量子点，再通过合物修饰表面使其具备官能团用于接下来的生物修饰。在登革热免疫分，它比市售最佳检测试剂的信号强度高出 4 倍，将检测限提高了 15 倍。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08

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