荧光探针在分子检测与细胞成像中的应用

发布时间：2020-05-29 01:29

【摘要】：分子影像学(molecular imaging)即对活体状态下的生物过程应用影像学的相关方法进行活体、组织、细胞甚至分子水平的定性与定量研究,是近年来科学研究非常热门的一个前沿领域,在肿瘤的早期影像诊断,细胞信号,疾病机制研究,药物研发,药物传递,药效评价,以及超分子水凝胶材料等方面有着广泛的应用。近年来发展的分子成像技术有放射性核素成像技术包括单电子发射计算机断层扫面和正电子发射断层扫描,核磁共振成像技术,计算机断层扫面成像,超声成像,光学成像,其中包括生物发光成像、化学发光成像,荧光成像,光声成像,各种成像技术在灵敏度、时间空间分辨率以及组织穿透率等性质上有自己的特点和优势。但是由于多方面的因素,实际成功用于临床诊断的分子成像的试剂却很少,仍然具有巨大的挑战性。综合上述分子成像技术的发展,我们设计并合成了几个小分子探针用于高选择性高灵敏性检测相关的重要生物分子(活性氧簇,蛋白酶,金属离子等),并用于细胞内外的成像分析。本论文主要包括一下三个工作:(1)一氧化氮(NO)是人体内第一大普遍存在的信号分子,其他两个信号分子分别是硫化氢(H2S)与一氧化碳(CO)。体外和体内对一氧化氮的高选择性和高敏感性检测具有重要意义,但目前的研究仍面临挑战性。之前报道的一些用于NO检测的荧光探针要么水溶性差,要么缺乏对细胞内生物分子的选择性。因此,我们合理地设计了一种水溶性、生物相容性、小分子探针:邻苯二胺-Phe-Phe-OH(1),用于高选择性和灵敏地检测体外和活细胞中的一氧化氮。探针1可以与NO反应,并通过ICT机制在367 nm处产生荧光发射。体外实验表明,探针1对NO的检测具有很高的选择性和灵敏性,不受常见的阴离子,ROS/RNS和细胞内生物分子DHA、AA、MGO的干扰。在PBS缓冲溶液中,1可用于检测0-12 μM的NO浓度,其最低检测限为6 nM。此外,探针1还成功用于检测活细胞内产生的一氧化氮。(2)聚集诱导发光效应(AIE)近年来被广泛应用于生物标记物的检测中。但是开发智能荧光探针来有效聚集具有AIE性质的荧光发射基团从而进一步增强荧光仍然具有很大的挑战性。本课题研究中,通过将生物相容性的点击缩合反应(CBT-Cys)与具有AIE性质的荧光基团相结合,我们合理地设计了一种“智能”双重聚集诱导发光的AIE探针AC-Arg-Arg-Cys(StBu)-Lys(TPE)-CBT(1),可用于活细胞内Furin活性的增强荧光检测。与单重聚集诱导发光的探针Ac-Arg-Val-Arg-Lys(TPE)-OH(1-Ctrl)相比,探针1在弗林酶作用下的荧光发射在体外和活细胞中分别增加了1.7倍和3.4倍。该智能的双重聚集诱导发光的探针有望在不久的将来进一步设计后,广泛应用于生物分子传感器检测或细胞成像检测酶活性以显著提高检测的灵敏度,甚至有望用于活体动物的实时成像分子。(3)钙(Ca2+)作为细胞中最重要的离子之一,在电活动和生物过程中起着至关重要的作用。由于细胞内环境复杂,在体内很难测定细胞的Ca2+浓度。根据已经报道的一些研究成果,细胞内核磁共振是获取细胞内成分实时信息的有效手段。本课题中,我们设计并和合成了一种基于1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)的新型钙离子敏感的,细胞渗透性的19F核磁共振探针5TFM-BAPTA,BAPTA结构可与钙离子特异性结合。探针5TFM-BAPTA与Ca2+结合后19F核磁共振信号的化学位移发生变化,因此我们可以区分不同Ca2+浓度,并得到了其体外关系的拟合曲线,实现定量和定性检测。该探针能以乙酯的形式穿透质膜,乙酯在细胞质中被相应的酯酶水解,因而探针进入细胞后可与细胞内Ca2+结合。这种乙酯的形式还可以防止探针与细胞外的Ca2+结合。通过将产生的19F的化学位移与拟合曲线进行比较,还可以对细胞质中的裂解酯酶进行初步的半定量分析。该探针成功用于细胞裂解液中Ca2+浓度的检测。细胞实验中,利用该探针我们发现细胞中存在两种不同水平的Ca2+浓度分布,推测低浓度的分布可能代表胞质中的Ca2+,而高浓度分布可能是由于内质网(ER)中Ca2+浓度较高所致。上述实验现象表明,钙离子敏感的19F磁共振探针能区分不同细胞器中不同浓度的Ca2+。
【图文】：

逡逑图１．１分子成像技术的方法与步骤＇逡逑其中关键在于能够实现特异性ＩＧ向的成像分子探针（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐｒｏｂｅ）的设逡逑计，如图１．２所示＂，一般的分子探针通常使用小分子，肽链，蛋白，抗体等实现逡逑靶向目标物质，使用化学标记，包括放射性标记，磁共振信号标记，光学标记等逡逑提供成像的检测信号。另外一些较为复杂的分子探针还可以包含多个组成部分，逡逑实现多模态多功能成像＂，１２。逡逑Ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｐｒｏｂｅ邋ｄｅｓｉｇｎ逡逑Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｍｏｔｅｔｙ逦Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋ｌｉｇａｎｄ逡逑Ｖｅｈｉｃｉｅ／ｃａｒｒｉｅｆ逡逑ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｗｉｔｃｈ逦Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ逡逑ＡｃｔｉｖＭａｌ？ｉ？邋ｂｙ邋ａ逦？逦Ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｔｏ逡逑ｂｉｏｉｏｇｉｃａｉ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋Ｂｏｄｙ邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ逦Ｂｋ＞ｋ？９（ｃａｌ邋ｔａｒｇｅｔｓ逡逑Ｐｈｏｔｏ－ｃｈ？ｍ？ｃｉｉｌ邋ｓｗｉｔｃｈｅｓ逦Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ邋ｒｏｕｔｅ逦（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ／Ａｎｔｉｇｅｎｓ｝逡逑（ＦＲＥＴ

图１．１分子成像技术的方法与步骤＇逡逑其中关键在于能够实现特异性ＩＧ向的成像分子探针（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐｒｏｂｅ）的设逡逑计，如图１．２所示＂，一般的分子探针通常使用小分子，肽链，蛋白，抗体等实现逡逑靶向目标物质，，使用化学标记，包括放射性标记，磁共振信号标记，光学标记等逡逑提供成像的检测信号。另外一些较为复杂的分子探针还可以包含多个组成部分，逡逑实现多模态多功能成像＂，１２。逡逑Ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｉｍａｇｉｎｇ邋ｐｒｏｂｅ邋ｄｅｓｉｇｎ逡逑Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｍｏｔｅｔｙ逦Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋ｌｉｇａｎｄ逡逑Ｖｅｈｉｃｉｅ／ｃａｒｒｉｅｆ逡逑ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｗｉｔｃｈ逦Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ逡逑ＡｃｔｉｖＭａｌ？ｉ？邋ｂｙ邋ａ逦？逦Ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｔｏ逡逑ｂｉｏｉｏｇｉｃａｉ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋Ｂｏｄｙ邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ逦Ｂｋ＞ｋ？９（ｃａｌ邋ｔａｒｇｅｔｓ逡逑Ｐｈｏｔｏ－ｃｈ？ｍ？ｃｉｉｌ邋ｓｗｉｔｃｈｅｓ逦Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ邋ｒｏｕｔｅ逦（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ／Ａｎｔｉｇｅｎｓ｝逡逑（ＦＲＥＴ
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R318

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本文编号：2686158