具有成骨、成血管特性的三维微组织的异位成骨实验研究

发布时间：2020-06-01 20:38

【摘要】：目的:将兔骨髓间充质干细胞,成骨细胞以及人脐静脉内皮细胞共培养体外构建三维微组织,并植入裸鼠皮下观察其异位成骨的能力。方法:1.兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离与培养:全骨髓贴壁法获得rBMSCs并培养纯化,贴壁细胞达到90%左右时传代,进行形态观察及生长记录。2.兔成骨细胞的诱导分化:取融合至80%-90%的P2代rBMSCs,更换为成骨诱导液进行诱导成骨,连续诱导14天后收获以进行后续实验并检测成骨特性。3.人脐静脉内皮细胞的复苏与培养:将液氮中冻存的人脐静脉内皮细胞取出,水浴复苏原代细胞,显微镜下观察形态及生长状况,传代培养后用于后续实验。4.三维微组织的体外构建:将三维微组织分为两组,一组为成骨细胞与间充质干细胞1:1混合(OB组),以5×10~4个/cm~2的密度接种至96孔低黏附培养板中,隔天换液培养7天;一组为成骨细胞、间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞1:1:1混合(共培养组),同样以5×10~4个/cm~2的密度接种至96孔低黏附培养板中,隔天换液培养7天。5.两组三维微组织植入裸鼠皮下:将每96个微球注射植入一只裸鼠皮下位点,于植入后2周、4周通过大体观察、HE染色、茜素红染色、碱性磷酸酶染色及CD31免疫荧光染色等检测植入微球的成骨能力和成血管能力。结果:1.成功分离培养兔骨髓间充质干细胞,细胞呈长梭形,旋涡状生长。2.成功诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,成骨细胞呈多角形或立方形,表面有短突起,茜素红染色见橙红色钙结节。3.复苏人脐静脉内皮细胞:人脐静脉内皮细胞复苏后为P1代,贴壁生长,呈“铺路石状“排列。细胞扁平多角形。4.成功构建三维微组织:细胞在96孔低黏附培养板中培养1周,肉眼观察可见细胞聚集成球状,两组茜素红染色及碱性磷酸酶染色表明两组微球均有成骨能力,CD31免疫荧光显示共培养组有成血管潜力。5.植入2周,OB组与共培养组植入位点均发现组织结节,4周后,两组植入位点处组织结节变小,边界清晰,表面按压较硬。HE及茜素红染色发现共培养组较OB组成骨多,CD31染色发现共培养组形成血管数目远多于OB组。结论:1.使用低黏附培养板可以比较简单易操作地形成三维微组织,且其质地较为紧密。2.用骨髓间充质干细胞、成骨细胞及人脐静脉内皮细胞体外构建的三维微组织植入裸鼠体内后具有成骨成血管的能力。
【图文】：

约覆盖培养瓶底部 40%。72 小时后，细胞分裂增殖状况良好（图1A），贴壁细胞呈短梭形、多角形，继续再培养 2 天，细胞呈集落形生长，形状变为长梭形，培养至 1 周时，多个细胞集落相互融合，细胞融合约 90%时，传代培养，24 小时后细胞贴壁，呈长梭形，48 小时后迅速增殖，继续培养 3-4 天，细胞再次融合覆盖瓶底，呈漩涡或平行状（图 1B）图 1 兔骨髓间充质干细胞培养 2 天和 10 天图注：A 为培养 2 天时由块状骨髓爬行生长的兔骨髓间充质干细胞；B 为培养 10天时的兔间充质干细胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨细胞诱导分化形态观察兔骨髓间充质干细胞传代至 P2 代后

图 1 兔骨髓间充质干细胞培养 2 天和 10 天图注：A 为培养 2 天时由块状骨髓爬行生长的兔骨髓间充质干细胞；B 为培养 10天时的兔间充质干细胞（scale bar=100μm）3.2 兔成骨细胞诱导分化形态观察兔骨髓间充质干细胞传代至 P2 代后，，细胞形态均匀，呈长梭形（图 2A），诱导 7 天后，细胞变大变短，表面有细小突起，胞核变大而圆（图 2B），诱导 14 天后，细胞变为多角形或立方形，表面短突起与相邻细胞连接，胞核位于细胞一端（图 2C）
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R68;R318.08

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本文编号：2692032