不同保存方法对纯钛表面理化性能以及生物活性的影响

发布时间：2020-06-06 12:53

【摘要】：研究背景：尽管人工种植牙应用于临床已将近半个世纪,并且被广泛证实具有可靠的临床效果,但是仍然存在着以下问题：(1)种植体植入体内到临床负重仍需要较长的愈合时间,最少需要6-12周的时间,这一定程度上限制了种植修复的临床应用；(2)种植体与骨的结合率仍然较低,只有50～65%,不利于种植体的长期稳定。加快种植体-骨结合的速度不仅仅意味着修复时间的缩短,更重要的是使人工牙种植具有更高的安全性。研究表明,大部分的种植失败发生于种植体早期愈合的过程中,愈合时间越长,种植体受到各种风险因素的影响越大,种植失败的风险越高。因此,更快更好的骨结合仍然是我们追求的目标。大量的研究表明,种植体与骨组织形成结合的速度和强度与种植体表面的生物活性密切相关,而生物活性又与种植体表面的理化性能紧密相连。生物活性(bioactivity)是植入材料能够与生物组织形成键合(Bone-bonding)的特性。即无论表面是否光滑,生物活性材料也能与生物组织产生直接的化学键性结合。由于钛及钛合金的结构和性质与骨组织差异很大,加之表面钝态氧化膜的存在。通常不能像生物活性材料那样与骨组织发生化学键性结合。因此,一般认为钛金属为生物惰性材料,并努力寻求各种方法进行表面活化改性。钛的生物活化是指使钛金属经过表面处理后,能够在生理环境诱导下,使羟基磷灰石层在其表面形成,与骨组织实现直接的化学键结合。增加钛表面的生物活性有以下两种思路：(1)通过表面加成法在钛表面涂覆生物活性涂层(如羟基磷灰石、钙磷酸盐、生物大分子等)；(2)通过表面改性使原钝化态氧化膜转化为活化态氧化膜或其他活性膜(如钛酸盐,Ca+Ti, TiO2+Ca+P膜等)。目前,常用的一些表面处理技术包括喷砂酸蚀,微弧氧化,羟基磷灰石涂层等等。与光滑种植体表面相比,这些表面处理技术明显改善了种植体的表面活性,促进了种植体-骨的结合。其中,紫外线光催化技术是近几年的研究热点之一。1997年,Wang等首先发现了紫外线照射TiO2膜上可以获得高亲水性表面的现象,并在Nature上发表。此后,大量的学者对此进行了深入的研究。本课题组通过紫外线光催化技术处理纯钛表面,成功获得了具有高表面能及高生物活性的表面,促进了蛋白质吸附、成骨细胞的黏附、增殖、分化和矿化。但进一步的研究结果表明,通过紫外线光催化技术获得的高表面能及高生物活性效应具有一定的时效性。经过一段时间的保存后,这种效应逐渐消失,钛片表面的生物活性明显降低。另外,在经过其他表面处理方式制备的钛表面上,也出现了钛表面生物活性随着保存时间的增加而下降的情况,即钛表面生物活性的老化现象(time-dependent degradation))。由此可见,钛表面生物活性的老化是钛基种植体普遍存在的现象。目前,导致钛表面理化性能和生物活性随时间下降的原因尚未明确。有研究认为,这可能与钛表面在储存的过程中受到空气中碳氢化合物的污染,导致表面元素构成的改变及表面能下降有关。由于常规的种植体保存方式为常温常压保存于密封瓶里,可能会受到碳氢化合物的污染,因此,在储存的过程中钛表面理化性能及生物活性可能已经发生变化,这值得我们深入研究。由于在实际应用中,临床医生不可能获得新制备的钛种植体,应用到临床上的种植体均经过或长或短的保存时间,可能出现了不同程度的生物活性的下降,因此,如何保持种植体的表面活性已成为一个重要的研究课题。本研究首先从保存方法的角度出发,研究不同保存方法对钛表面的理化性能及生物活性的影响,以尽可能保持钛表面的生物活性,使应用到临床上的种植体具有更佳骨结合效能。研究目的： 1.探讨常规保存方法下,纯钛表面理化性能的时间性变化以及对生物活性影响。 2.探讨不同保存方法对纯钛表面理化性能及生物活性的影响,以及探讨其可能的机制。研究方法： 1.钛片的制备及分组将商用二级纯钛(TA2)切割成直径15mm,厚度1.5mm的钛片后,通过H2SO4(49%)/HCl (18%)酸蚀法制备出具有一定的粗糙度,表面形态较为均匀,可重复性较高,表面清洁度良好的钛表面用于本实验。第一部分实验：探讨常温常压保存方法下,纯钛表面理化性能的时间相关性变化及对表面活性的影响。分组：组1：新制备钛片；组2：避光保存于密封盒内3天；组3：避光保存于密封盒内2周；组4：避光保存于密封盒内4周。制备完成的钛片用于表面理化性能检测、蛋白质吸附及细胞培养实验。第二部分实验：探讨不同保存方法对纯钛表面理化性能及生物活性的影响。分组：组1：新制备钛片,即制备完成后即刻用于表面理化性能检测和细胞培养。组2：避光保存于密闭盒里。组3-5：制备完成后即刻保存于双蒸水(ddH2O)/氯化钠(NaCl)/氯化钙(CaCl2)溶液中。组2-5中的钛片根据实验设计,保存了3天,2周,4周不同时间,然后根据实验设计对钛片表面进行理化性能检测、蛋白质吸附及细胞培养实验。以上实验均在清洁环境中完成。 2.钛片表面理化性能的检测：通过扫描电镜观察、表面轮廓测量仪、X射线光电子能谱分析仪、水接触角分析仪等手段对不同处理组的钛片表面进行表面形貌、表面粗糙度、表面元素、表面亲水性进行检测。以评估不同组别钛片表面理化性能的差异。 3.蛋白吸附实验使用牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白,用于蛋白质吸附实验。BCA法在波长为562nm下测定OD值,根据标准曲线计算蛋白质吸附率(百分比)。 4.细胞培养实验选取MG63成骨细胞系用于本实验,接种密度为2.4×101个/cm2。在不同的培养时间点,通过荧光染色剂染色,荧光显微镜观察,MTS试剂盒、ALP试剂盒、茜素红染色等方法对细胞的黏附、增殖、分化以及矿化情况进行分析,以评估不同组别钛片表面的细胞生物活性。统计分析采用Spss13.0统计软件对各组间样品的表面理化性能、蛋白质吸附、细胞黏附、细胞增殖和分化方面各项参数进行统计学分析。测定结果以x±s来表示,用析因设计分析处理组与不同时段是否存在交互效应,如存在交互效应,组间进一步采用单因素方差分析(one-way ANO VA),然后采用Levene's test检查方差齐性,方差齐时对样本均数进行两两比较的LSD检验,方差不齐时,采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,Dunnett'T3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准a=0.05,当P0.05时,认为差异具有统计学意义,当P0.01时,认为差异具有显著的统计学意义。实验结果： 1.扫描电镜观察结果：各组的钛片均具有典型的酸蚀处理后的表面形态,呈较均匀的多孔状结构,孔径为1-3μm。表面轮廓仪分析证实,所有的表面具有相似的粗糙度,各项参数没有统计学差异。保存方式和保存时间对钛片的表面形态没有明显的影响。 2.X射线光电子能谱分析获得的新制备的钛片以及在其余4种不同方法中保存了3天,2周,4周不同时间的钛片表面的高分辨能谱图提示,所有样品的表面均可发现Ti、O、C和微量的N,但不同组别的元素比例差异较大。新钛片表面的碳元素含量最低,为26.0%。保存了3天后,在常温常压、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液下保存的钛表面C元素含量分别为36.3%、26.4%、26.7%、26.2%；保存了2周后,钛表面C元素含量分别为42.9%、29.8%、28.8%、28.2%；保存了4周后,钛表面C元素含量分别为48.2%、31.3%、30.7%、30.1%。不同组别间的Ti和O元素比例也体现出不同的变化。由此可见,在相同的保存时间点,保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的钛片表面碳元素显著低于常温常压下保存。但是需要注意的是,所有的保存方法都不能完全避免C元素的污染。 3.1μL ddH2O在各组不同钛片表面的静态水接触角表明,新制备的钛片表面表现出超亲水性的特性,当ddH2O接触到钛片表面时,便迅速向四周铺展,接近润湿整个钛片表面,静态水接触角为0°。当将钛片常温常压下保存时,随着保存时间的延长,钛表面由亲水性迅速向疏水性转变。在保存3天后,静态水接触角为变为59.70°；2周后,增加至90.27。；4周后,变为114.53。。而保存在ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中的钛片表面,在保存3天及2周后,静态水接触角仍然为0°,即便在第4周时,仍保持了超级亲水性(接触角5°)的特性。 2μL ddH2O在钛片上的接触面积表明,在常温常压保存方式下,ddH2O在钛片上的接触面积也随着保存时间的延长而剧烈减少。但是要注意的是,在这三种保存方式下,ddH2O在钛片表面的润湿面积也随着保存时间的延长而逐渐减小,但仍明显优于常温常压下保存的钛片表面。 4.不同处理组钛片表面1h的蛋白质吸附率结果提示：在常温常压保存方式下,钛片表面蛋白质吸附能力随着保存时间延长下降的程度比保存在ddH2O、NaCl溶液中的钛片表面明显,而保存在CaCl2溶液中的钛片表面蛋白质吸附能力保持了稳定性,未随着保存时间的延长而明显下降,在3天、2周及4周的保存时间里,保存在CaCl2溶液中的钛片表面均表现出了最高的蛋白质吸附能力,在保存了3天钛片表面,蛋白质吸附能力甚至略高于新钛片组。 5.在细胞培养实验中所选择的30min、1h、2h及4h四个时间点中,所有处理组的钛片表面的细胞黏附量均随着培养时间的增加而增加。新制备的钛片表面的细胞黏附效果非常好,细胞接种30min后,约有40%的细胞成功黏附,而在接种4h后,大部分的细胞已经黏附到钛片表面。在常温常压下保存了3天,2周及4周的钛片表面,同一细胞培养时间点的细胞黏附率随着保存时间的增加而显著减少。在常温常压下保存了4周的钛片表面,细胞接种30min后,黏附率仅为新制备钛表面的5%,即便经过4h的培养,也仅有50%接种细胞黏附到钛片表面。通过比较保存在常温常压密封盒内、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的钛片表面在30min、1h、2h及4h细胞黏附情况,可以发现,保存在常温常压密封盒内细胞的黏附效果最差,显著低于其它三种保存方法。所有的保存方法中,在CaCl2溶液中保存的钛片表面在4个培养时间点均表现出最好的细胞黏附率,与新制备的钛片表面无统计学差异。 6.细胞接种4h后,在荧光显微镜下观察不同处理组钛片表面细胞骨架的形态,可见新制备的钛片表面大部分细胞伸展良好,细胞呈扁平状,胞浆丰富,大量的伪足向四周伸出。在常温常压下保存了3天的钛片表面上,仅见少部分伸展良好的细胞,其余大部分细胞胞体较小,呈圆形或椭圆形,未充分展开,在保存了2周和4周的钛片表面上,几乎所有的细胞胞体都呈圆形或椭圆形,未充分展开。在保存于ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的钛片表面,细胞形态与新制备钛片表面上的细胞相近,大部分细胞伸展良好。 7.在细胞培养第1天和第3天,在常温常压下保存了3天,2周及4周的钛片表面,细胞的增殖活性均随着保存时间的增加而减少。通过比较保存在常温常压密封盒内、ddH2O、NaCl溶液、CaCl2溶液中4周的钛片表面的细胞增殖活性,可以得知,在细胞培养的第1天时,保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的钛片表面细胞增殖活性与新制备的钛片表面没有统计学差异,并且显著高于常温常压保存的钛片表面。在细胞培养的第3天时,保存在ddH2O、NaCl溶液和CaCl2溶液中的钛片表面细胞增殖活性依然高于常温常压下保存的钛片表面。其中,CaCl2组保存的钛片表面细胞增殖活性最好,显著高于保存在ddH2O及NaCl溶液中的钛片表面(p0.05),但与新制备的钛片表面没有统计学差异。 8.碱性磷酸酶是细胞分化的早期标志。在细胞培养的第7天,对各组细胞培养样本进行碱性磷酸酶活性的检测。结果发现,各组细胞的碱性磷酸酶活性没有显著的差异。钛片的保存方法不会显著影响细胞的碱性磷酸酶活性。细胞外基质矿化是通过茜素红染色来检测。实验证明,钛片表面细胞矿化能力受到保存方法的影响。常温常压保存的钛片表面细胞外基质矿化能力最低,显著低于其他组,而保存于CaCl2溶液中的钛片表面以及新制备的钛片表面的矿化能力最强。显著高于其它组。结论： 1.空气中碳氢化合物的污染显著影响纯钛表面的理化性能和生物学性能。 2.常规的保存方法将纯钛种植体置于密封瓶里面,不能避免种植体受到空气中碳氢化合物的污染。 3.将种植体保存在液体中,能显著减少碳氢化合物的污染,维持钛表面的高表面能。与常规保存方法相比,更有利于蛋白质吸附和细胞的黏附、增殖和分化。 4.保存液的离子对种植体的表面理化性能和生物活性也有影响,二价阳离子Ca2+更有利于蛋白质吸附和细胞的黏附、增殖和分化。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R783.1

【参考文献】