基于DNA-银纳米簇的转录因子荧光传感体系的构建及生物医学应用

发布时间：2020-06-11 09:16

【摘要】：转录因子(Transcription factors,TFs)是细胞中的一类调控蛋白,是细胞信号转导的最终效应器,它们通过与基因中的转录调节区结合,控制基因的表达,从而调控细胞的生长与分化。目前,已知的TFs已经有大约1500种,研究表明TFs异常表达与人类疾病有着密切的关系。例如,核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)被证实在大量病毒感染、肿瘤病例中发生上调;调节抑癌基因的p53蛋白在超过50%的肿瘤中失活;调控雌激素基因表达的雌激素受体(Estrogen receptor,ER)在乳腺癌、子宫内膜癌、精神疾病中均有异常表达。因此,TFs不仅是潜在的诊断标志物,也是治疗的靶点和药物研究靶标。正是由于TFs的重要地位,使得对TFs的高效检测具有重要的意义,但是目前能够同时满足高效、高灵敏、低成本的检测方法仍然缺乏。本文针对TFs的检测,以DNA-银纳米簇(DNA-silver nanoclusters,DNA-AgNCs)为纳米分析元件,从酶辅助信号放大、纳米复合体系、变构探针三个角度,研究了TFs传感分析体系,并将这些体系应用于TFs的生物样品检测,以及TFs抑制剂的筛选。各章内容概括如下:第一章基于DNA-银纳米簇与核酸外切酶III辅助信号放大的转录因子检测方法本章中,我们设计合成了DNA-AgNCs分子信标(DNA-AgNCs molecular beacons,AgMBs),并基于AgMBs与核酸外切酶III(Exonuclease III,Exo III)辅助的信号放大技术,开发了免标记(Label-free)的TFs荧光传感系统。通过Exo III的酶切作用,我们将TFs与对应双链结合序列的结合过程转化为一段单链DNA(reporter)的释放,然后AgMBs与Exo III共同作用实现对reporter的信号放大地检测。AgMBs中用以调控荧光信号增强的富含鸟嘌呤的增强序列(GRS)是一段未经修饰的DNA,为Exo III辅助的信号放大提供了原理基础,这也是AgMBs首次被用于信号放大系统。该传感系统能够对细胞核蛋白提取物中NF-κB p50进行定量检测,检测限为10 pM(S/N=3),并能用于该TFs靶向抑制剂的评价与筛选。进一步的,通过改变dsDNA的结合序列,该系统能够用于分析多种TFs,具有较好的普适性。第二章基于DNA-银纳米簇/聚吡咯纳米粒复合纳米材料的多通路转录因子荧光检测方法本章研究中,发卡状的DNA-AgNCs与聚吡咯纳米粒(Polypyrrole nanoparticles,PPyNPs)通过非共价作用相互吸附构建复合纳米材料DNAAgNCs/PPyNPs,并被用于TFs的检测。DNA-AgNCs通过单链的环部分吸附在PPyNPs的表面,导致DNA-AgNCs与PPyNPs相互接近而产生能量转移,导致荧光猝灭。加入目标TFs后,TFs与发卡状DNA-AgNCs的双链的茎部位结合,引发空间位阻效应驱使DNA-AgNCs从PPyNPs的表面解吸附,导致荧光恢复。基于PPyNPs的低非特异性蛋白吸附性质,本方法与已有的基于空间位阻效应的TFs检测平台相比灵敏度获得了显著提升,对NF-κB p50的检测限为70 pM(S/N=3),对p53的检测限为110 pM(S/N=3)。进一步的,利用DNA-AgNCs荧光可调控的性质,设计了两种具有不同荧光性质并能够分别识别不同TFs的DNAAgNCs,实现了对NF-κB p50于p53的荧光多通路检测。本章的研究通过结合DNA-AgNCs与PPyNPs的特点与优势,构建了高效的TFs检测平台。第三章变构DNA-银纳米簇探针用于转录因子的检测本章中,我们基于DNA-AgNCs构建变构的TFs探针,将其命名为变构DNA-银纳米簇开关探针(Allosteric DNA-silver nanocluster switches,AgSwitches)。DNA-AgNCs与GRS分别被设置于AgSwitches 5’末端与3’末端,当其与TFs结合后,在TFs诱导的变构作用以及不同构象之间的平衡移动原理作用下,AgSwitches从弱荧光的双茎-环构象变构为强荧光的单茎-环构象,从而实现对TFs的荧光检测。研究发现,可以利用在线服务器NUPACK对AgSwitches的序列进行设计优化,并提出了基于模拟吉布斯自由能优化序列设计的初步原则。本实验所获得的AgSwitches能够对TFs实现高灵敏、高特异性地检测,并能够用于实际样品分析。该方法也能够用于对TFs靶向抑制剂进行筛选,在医药研究领域具有发展潜力。本章研究设计了基于DNA-AgNCs的变构DNA纳米机器,研究了其热力学性质与分析性能之间的关系,并最终将其成功应用于TFs相关的生物医学研究。
【图文】：

南京医科大学博MBs 的制备Bs 根据文献提供的方法合成[36]。首先进行变温处理：将 1OD 75 μL 缓冲液中（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COOCOO)2, pH 7.5），加热至 95℃，维持 10 min 后缓慢降温至 25为 1h。然后进行原位还原：加入 12μL，10mM 新制 AgNO3避光 4 °C 反应 30 min。接着，迅速加入 12 μL，10 mM 新制振摇混合 1 min，然后避光 4 °C 反应过夜。图 1 为 AgMBs 制

然后避光 4 °C 反应过夜。图 1 为 AgMBs 制备过程的示意图。图 1AgMBs 制备过程的示意图2.4 样品处理及荧光检测将 NF-κBp50 的母液（0.5mg/mL）用含有 10%甘油的磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.4）稀释分装。每 100 nM 的 dsNF-κBprobe 与不同浓度的 NF-κBp50 溶液，以及 10 μL 的结合缓冲液（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COONa, 10mM Mg(CH3COOH)2, 10% glycerol, 0.05 mg/mL poly(dI-dC), pH 7.4）混合。随后，加入 2μL（10U/μL）的 ExoIII，以及 3μL 的 10×反应缓冲液，用来对 dsNF-κBprobe 进行酶切。随后，向体系中加入 AgMBs（1 μM，10μL）
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318

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本文编号：2707697